金属蛋白酶ADAMTS-7在软脚骨发育以及骨关节炎发病机制中的作用研究

摘要

关节炎是一组以关节软骨破坏及关节周围软组织炎症为特征的慢性疾病。其中最常见的关节炎类型为骨关节炎，以关节软骨的破坏与降解为主。另一常见类型为类风湿关节炎，是一类慢性全身性自身免疫疾病，以滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现。关节炎的发病趋势随着人口高速增长以及全球人口老龄化的加剧而日趋严重，但是目前为止，关节炎发病的具体病因，发病机制仍不明确。ADAMTS(ADisintegrinandMetalloproteinasewithThrombospondinmotifs)含TSP样基序的去整合素金属蛋白酶家族，为一组结构相似的分泌性锌结合蛋白酶，目前已发现19个成员，它们的蛋白结构具有高度的相似性，在体内以多种细胞外基质成分为底物，而且它们在胚胎发育、血管生成、凝血等生理过程中具有重要功能。研究表明ADAMTS-7的表达水平在关节炎病人软骨中明显上升，但是其在关节炎发病机制中的今天作用尚不清楚。我们运用转基因技术与RNAi基因下调技术建立了小鼠模型，对ADAMTS-7的功能进行了进一步的研究。
　　 一.ADAMS-7在骨关节炎发病机制中的作用研究
　　 ADAMTS-7属于ADAMTS家族成员，以往的研究表明ADAMTS-7结合并降解软骨寡聚基质蛋白(cartilageoligomericmatrixprotein，COMP)，同时其表达水平在关节炎病人中明显上调。此外，后续的体外实验研究还发现ADAMTS-7在调节软骨发生中起到重要的作用，为了更好地阐明其在软骨发育以及关节炎发病过程中的功能，我们率先构建了人ADAMTS-7转基因小鼠，采用软骨细胞特异性Ⅱ型胶原纤维(Co(l)2a(1))作为转入基因的启动子，我们发现新生的ADAMTS-7转基因小鼠体型明显小于野生型对照小鼠，X光片显示转基因小鼠骨骼发育明显滞后，无论是长骨的长度和密度都明显低于野生型小鼠。钙黄绿素双标实验显示新生小鼠的新骨形成率明显低于对照小鼠，番红染色显示转基因小鼠的生长板只有其对照小鼠的一半长度，同时生长板肥大区长度也显著短于对照小鼠。阿而新蓝及茜素红全骨骼染色显示ADAMTS-7转基因小鼠的成骨发育明显滞后与正常野生型小鼠。然而，转基因小鼠在出生5周后达到了正常对照小鼠的体重和体型，并检测不到任何发育异常。我们同时运用Cre/loxp重组系统建立了表达ADAMTS-7特异性SiRNA的小鼠即ADAMTS-7基因下调小鼠，但在其成骨发育发育方面未见任何异常，这可能与ADAMTS家族别的蛋白成员进行了功能代偿有关。
　　 我们发现8月龄ADAMTS-7转基因小鼠自发地形成了骨关节炎的表型，而其相应对照小鼠并无明显异常。MicroCT扫描发现转基因小鼠膝关节骨赘形成，番红染色显示其有显著的关节软骨蛋白聚糖丢失，并伴随有半月板软骨的骨化，同时我们还观察到在其关节软骨中软骨细胞团集，关节软骨中层与下层钙化软骨分界潮线不规则并上移至软骨表层，这些都是骨关节炎的特征组织学表现。
　　 为进一步探讨ADAMTS-7在骨关节炎发生及发展中所起的作用，我们建立了手术诱导的骨关节炎模型（切断中半月板与胫骨之间的韧带以造成膝关节的不稳定），组织学分析显示转基因小鼠在术后4周就开始出现中度的蛋白聚糖丢失，而其相应的对照小鼠知道术后12周后才开始表现出中度的蛋白聚糖丢失。组织学评分显示相同时间点转基因小鼠术后关节炎评分明显高于对照小鼠。除此以外，软骨寡聚基质蛋白COMP降解水平在术后转基因小鼠中明显高于对照小鼠。我们的前期研究发现，肿瘤坏死因子α作为一种重要的促炎因子能够明显促进ADAMTS-7的表达，同时转基因小鼠中肿瘤坏死因子α也被明显上调，我们还采用了软骨体外培养加入纯化的ADAMTS-7重组蛋白，也观察到类似的肿瘤坏死因子α被上调现象，这表明ADAMTS-7和肿瘤坏死因子α两者之间存在正反馈通路。
　　 二.软骨寡聚基质蛋白COMP作为关节炎生物标记分子的研究
　　 关节炎作为一类高发疾病，其早期诊断以及早期干预治疗尤其是在关节软骨尚未出现明显丢失之前显得极为重要。软骨寡聚基质蛋白是软骨中的一种非胶原组成成分。其降解片段水平在疾病的软骨，关节腔滑液以及关节损伤、关节外伤后、骨关节炎和类风湿关节的病人血清中明显上升。虽然市场上已有若干商业化的COMP酶联免疫法检测试剂盒可以用于检测人血清中的COMP水平，但是其限制是它们缺乏对COMP降解片段的特异性，这也就阻碍了COMP作为临床上监测关节炎的生物学标记的应用。我们制备了一批重组针对COMP蛋白片段的鼠源单克隆抗体，并对它们进行了详细地分析，发现其中2127F5B6单抗优先识别COMP羧基端降解片段。我们以此抗体作为检测抗体结合COMP多克隆抗体建立了全新的COMP夹心酶联免疫检测方法。与商业化的试剂盒比较显示，商业化检测的COMP水平不能对有明显症状的骨关节炎病人和非病人进行区分，而我们建立的新方法能够检测到两者之间明显的差别，骨关节炎病人血清中COMP片段水平明显高于非关节炎组。此外，血清COMP水平还与骨关节炎病人的影像学分级有很好的相关性，病情越重，关节软骨破坏越厉害，COMP水平越高。值得注意的是，类风湿关节炎病人在使用甲氨蝶呤(MTX)和肿瘤坏死因子抑制剂(TNFinhibitors)治疗后，部分病人的血清COMP水平比用药前的COMP水平明显下降，通过对治疗前后病情评分DAS28的评定标准发现这部分病人正是类风湿药物敏感病人，因此COMP的水平检测能够协助医生进行药物疗效的监测以便制定更佳的治疗方案。
　　 不同于大部分现有的COMPELISA检测试剂盒，只适用于某一特定物种，我们的方法除可用于人COMP蛋白检测，此方法也适用于小鼠。
　　 综上所述，靶向性的ADAMTS-7在软骨细胞中的过表达抑制幼龄小鼠的软骨发生与成骨发育，而在成年小鼠中它导致骨关节炎表型的出现，同时它也促进了手术诱导骨关节炎模型的发生并加快了疾病的发展。ADAMTS-7调控骨关节炎进展一是通过降解软骨寡聚基质蛋白导致软骨基质网络失去平衡，二是其通过诱导肿瘤坏死因子α，而肿瘤坏死因子α反过来又可激活其它降解软骨软骨基质的金属蛋白酶，例如基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶-13以及ADAMTS-4、ADAMTS-5。这些发现不仅阐述了ADAMTS-7在软骨发育及关节炎发病中的作用，同时也为今后骨关节炎的干预治疗策略提供了新的靶点。
　　 同时我们建立了一种新型COMP蛋白夹心ELISA检测方法，对蛋白酶降解的COMP片段具有较高亲和力，这种方法能够更为准确的评价软骨破坏程度，使得COMP能够作为关节炎的特异性生物标记分子，对于及早诊断关节炎，制定诊疗方案、观察病情发展、监测药物疗效、预测疾病预后等具有重要的临床应用价值。