猪型布鲁氏菌Omp31-BLS融合肽的诱导表达与多克隆抗体的制备

摘要

布鲁氏菌病（简称“布病”），是由布鲁氏菌（Brucella）侵入动物机体引起的传染性共患疾病。不仅危害动物机体，而且在与其相关食品和物品中传播，严重危害畜牧业发展，威胁人类生命健康。布病在我国波及多个地区，且发病率逐年上升，频繁发生的疫情，已成为影响畜牧业良性发展的一大难题。
　　本研究对Omp31的基本性质进行了分析，并作出表位预测。发现布鲁氏菌Omp31可分为两大类Omp31-a和Omp31-b。本实验选用的猪型布鲁氏菌S2减毒活菌苗中的Omp31蛋白属于Omp31-a亚类。对该菌Omp31蛋白的各项分析显示：该蛋白是一种β折叠桶形的跨膜脂蛋白质；分子N末端具有信号肽序列；在48-74及193-227两处氨基酸残基序列，作为抗原决定簇所在区域的可能性较大。
　　此外，本文以猪型S2菌基因组DNA为模板，PCR扩增获得 omp31、bls全长基因片段，omp3148-74抗原表位基因片段和N端缺失27个碱基的bls基因片段。bls全长基因片段插入pET-28a质粒载体，成功构建重组质粒载体pET-bls，经PCR、双酶切和测序鉴定正确后，IPTG诱导表达出目的重组蛋白 rBLS。omp31抗原表位基因片段和N端缺失27个碱基的bls基因片段通过融合PCR进行重组后，插入pET-28a质粒载体，成功构建重组质粒载体 pET-omp3148-74-bls，经 PCR、双酶切和测序鉴定正确后，IPTG诱导表达出目的重组蛋白rOmp3148-74-BLS。SDS-PAGE分析显示：两种重组蛋白均以包涵体形式存在，经包涵体处理和His-tag亲和层析柱纯化，分别得到21 kD和23 kD重组蛋白。利用两种重组蛋白免疫家兔，获取的抗血清通过Western blot实验检验其免疫效果，结果显示：两种蛋白均能被兔血清特异性识别，而空白对照并不与抗血清产生特异性反应，证明目的蛋白具有良好的抗原特异性，有望应用于布鲁氏菌相关疫苗的研制。

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引 言

1 文献综述

1.1世界布病疫情概况

1.2布鲁氏菌疫苗研究策略的演化

1.3防御布病传播的常用疫苗

2实验内容

2.1实验材料

2.2实验试剂及配方

2.3试剂盒

2.4主要实验仪器

2.5实验动物

2.6实验方法

3结果

3.2猪型布鲁氏菌omp31基因测序结果

3.3猪型布鲁氏菌Omp31氨基酸序列同源性分析

3.4猪型布鲁氏菌Omp31蛋白质分子的结构预测

3.5猪型布鲁氏菌Omp31蛋白质分子信号肽分析

3.6猪型布鲁氏菌Omp31蛋白质分子抗原决定簇的预测

3.7抗原决定簇预测结果的实验证据

3.8猪型布鲁氏菌bls基因PCR扩增结果

3.9 pET-bls阳性重组子菌落PCR验证结果

3.10 pET-bls阳性重组子EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切验证结果

3.11 pET-bls阳性重组子基因序列测序结果

3.12猪型布鲁氏菌omp3148-74-bls融合基因的PCR扩增结果

3.13 pET-omp3148-74-bls阳性重组子菌落PCR验证结果

3.14 pET-omp3148-74-bls阳性重组子EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切验证结果

3.15 pET-omp3148-74-bls阳性重组子基因序列测序结果

3.16重组蛋白rBLS和rOmp3148-74-BLS的诱导表达结果

3.17 rBLS融合蛋白的纯化结果

3.18 rBLS融合蛋白预测

3.19 rOmp3148-74-BLS融合蛋白的纯化结果

3.20 rOmp3148-74-BLS融合蛋白预测

3.21多克隆抗体Western blot检测结果

3.22猪型布鲁氏菌内源性蛋白的免疫识别检测结果

结 论

参考文献

在学研究成果

致谢