用斑马鱼模型研究SLC33A1基因在遗传性痉挛性截瘫发生中的作用及其机制

摘要

SLC33A1基因（solute carrier family33，member1），又名AT-1(the acetyl-CoAtransporter1)，定位于人类染色体3q25，最早是在研究神经节苷脂O-乙酰化的过程中被发现的，它可以将细胞质中的乙酰辅酶A转运至高尔基体中，为神经节苷脂的O-乙酰化提供乙酰基。研究显示SLC33A1可以调节很多内质网蛋白的乙酰化状态，这些蛋白包括β-site APP cleaving enzyme1(BACE1)、低密度脂蛋白受体和淀粉样蛋白前体等，而这种存在于分泌途径中的蛋白质翻译后修饰对于膜结构和分泌蛋白的组装及运输至关重要。 截止目前，SLC33A1被发现至少参与了四种神经变性疾病的发生和发展:散发性肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）病人的残存运动神经元中SLC33A1的表达量显著上调;晚发性阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)病人的额叶脑组织中SLC33A1基因mRNA的表达量是正常对照的三倍以上;中国山东青岛地区一遗传性痉挛性截瘫(hereditary spastic paraplegia,简称HSP或SPG)家系中患者均携带p.S113R错义突变。近期研究显示SLC33A1基因纯合突变或者复合杂合突变会导致致死性的、常染色体隐性遗传性先天性白内障、听力丧失、低铜及低铜蓝蛋白综合征的发生，患者有显著的小脑发育不全和脱髓鞘病变的表现。说明SLC33A1在生理和病理状态下都发挥着重要作用。 遗传性痉挛性截瘫是一种上运动神经元疾病，以双下肢进行性肌张力增高和无力、剪刀步态为特征的具有显著遗传和临床异质性的综合征，其主要的病理改变是脊髓中双侧皮质脊髓束的轴索变性和脱髓鞘，以胸髓为重。肌萎缩侧索硬化是最常见的成人发病的运动神经元疾病，它累及上/下运动神经元，患者发病后一般五年内死亡。阿尔茨海默病即老年痴呆临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍，其主要病变是神经细胞的不可逆性死亡。既然已知SLC33A1参与了以上疾病的发生发展，提示SLC33A1对于神经元的存活及正常功能的维持尤为重要，但SLC33A1是如何影响ALS、HSP和AD的进展，以及p.S113R突变在遗传性痉挛性截瘫发生中的作用尚不明确。深入探讨SLC33A1蛋白的功能及这些疾病的发病机制十分必要。 生物医学研究离不开动物模型的应用，借助动物模型可以从分子、细胞和整体水平系统分析疾病的发生机制，并探索新的治疗方法。斑马鱼（Danio rerio）作为一种新兴的脊椎动物模型，它的生长发育过程、组织系统结构与人类有很高的相似度，两者的基因和蛋白在结构和功能上也高度保守;就神经系统而言，斑马鱼的中枢神经系统已分化出前中后脑、小脑和脊髓，外周神经系统也有感觉神经和运动神经之分，在受精后一天内就能发育出完备但相对简单的神经系统，成为研究神经系统疾病的良好模型。同时，基于吗啉反义寡核苷酸(morpholino，MO)的knockdown技术已成为斑马鱼研究中的金牌技术，它是反义技术的一种，通过阻断蛋白质翻译过程而达到抑制目标基因功能的目的。目前利用该技术已成功构建了多种运动神经元疾病的斑马鱼模型，包括ALS1、ALS2、脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy，SMA)、SPG4、SPG8、SPG11和SPG3A，它们都主要表现为运动神经元轴突发育异常及运动能力下降，很好地模拟了人类疾病的临床表现，印证了斑马鱼是研究遗传性痉挛性截瘫和肌萎缩侧索硬化等疾病的良好动物模型。 鉴于目前SLC33A1体内功能研究的缺乏及斑马鱼在运动神经元疾病研究中的成功应用，本课题以脊椎动物斑马鱼为模型，研究Slc33a1对脊椎动物运动神经元的影响和可能涉及的信号通路，探讨SLC33A1基因p.S113R突变在遗传性痉挛性截瘫发生中的作用及可能机制。研究分以下三部分: 第一部分斑马鱼slc33a1基因及其表达分析 本研究选择斑马鱼模型作为研究对象，首先分析了斑马鱼slc33a1的蛋白结构及其在发育过程中的表达模式: 1)我们从Genbank中调阅了斑马鱼、小鼠和人类SLC33A1的氨基酸序列，用Clustal(X)软件进行同源性比较，结果显示斑马鱼Slc33a1蛋白与人类和小鼠SLC33A1蛋白同源性高达69％，说明SLC33A1在进化上是高度保守的。 2)已知SLC33A1蛋白是一个膜蛋白，用预测膜蛋白二级结构的SOSUI软件预测了斑马鱼和人SLC33A1的蛋白结构，并进行比较。斑马鱼Slc33a1蛋白与人类蛋白一样含有12个跨膜结构域，其跨膜结构、胞外结构及胞内结构与人类蛋白也极其相近，提示两者蛋白功能是相似的，斑马鱼可以作为研究人SLC33A1功能的模型。 3)随后我们采用实时定量PCR方法检测了斑马鱼发育过程中各个时期（受精后0、3、6、9、12、24、36、48、72、96小时及成鱼）slc33a1基因mRNA表达水平，结果发现在受精后0小时即合子期就有母源性slc33a1 mRNA的表达，随后各发育阶段也有持续性表达且表达水平无明显变化，但成鱼slc33a1的转录水平明显升高。同时根据国际权威斑马鱼数据库zfin.org提供的slc33a1 mRNA原位杂交数据，slc33a1是一个广泛表达的基因，这也与人类的表达谱很近似，说明Slc33a1在斑马鱼发育早期即有表达，并参与斑马鱼整个生长发育过程。提示我们可以使用斑马鱼作为研究SLC33A1的模型。 第二部分 Slc33a1 knockdown斑马鱼的表型分析 Morpholino是一种反义寡核苷酸技术，以吗啉环类似物为基本骨架，这种独特的结构特性使其能够抵抗核酸酶的作用。它可以与靶序列即某一RNA通过碱基互补配对的原则牢固结合，通过空间位阻效应妨碍翻译起始复合物的形成及移动，从而阻断蛋白质翻译过程达到抑制目标基因功能的目的。我们首先使用该技术构建了slc33a1功能研究的斑马鱼模型，随后针对HSP、ALS等运动神经元疾病的临床表现、病理特征、结合已有运动神经元疾病斑马鱼模型的研究成果对该模型从整体到微观多个层面进行了观察分析: 1)设计合成了针对斑马鱼slc33a1 mRNA的Morpholino及对照，通过显微注射导入1-4细胞期的受精卵中。因Morpholino作用的发挥是在转录后水平，我们收集发育24小时的胚胎，采用Western blot的方法检测Slc33a1蛋白的表达量证实slc33a1 MO在斑马鱼体内能有效抑制slc33a1的表达。同时利用体外转录翻译偶联系统在体外也进行了论证。说明本研究中使用的Morpholino可以特异性地抑制斑马鱼slc33a1的表达，通过显微注射slc33a1 MO至斑马鱼受精卵能够建立SLC33A1功能研究的动物模型。 2)Slc33a1 knockdown的斑马鱼在发育的早期就表现出不同程度的尾部发育不良及尾部弯曲表型，同时伴随着一定比例斑马鱼的死亡，这与遗传性痉挛性截瘫SPG4、SPG8、SPG11斑马鱼模型及肌萎缩侧索硬化ALS2斑马鱼模型是相似的。说明虽然HSP在人类到儿童或青少年期才发病，ALS多为成年发病，但SLC33A1也是影响早期发育的重要因素; 3) Slc33a1 knockdown的斑马鱼在48hpf时出现显著的运动能力下降，表现为touch-evoked swimming运动的异常，即用探针刺激斑马鱼尾部时没有出现有效的游泳运动或者完全丧失运动能力，这与遗传性痉挛性截瘫SPG4、SPG11和SPG3A的斑马鱼模型及肌萎缩侧索硬化ALS1和ALS2的斑马鱼模型也是一致; 4)显微注射slc33a1 MO，斑马鱼出现初级和次级运动神经元轴突生长异常，表现为轴突截短和分叉增多，而中间神经元和感觉神经元并不受影响。同时我们观察到中枢神经系统中脊髓和后脑的运动神经元排列紊乱甚至缺失。说明Slc33a1对运动神经元及其轴突的生长发育至关重要。运动神经元疾病主要的病理改变为上/下运动神经元及其轴突的退行性变，而目前所有的HSP和ALS的斑马鱼模型均有轴突异常的表型。 第三部分用斑马鱼模型证实SLC33A1基因p.S113R突变是致病突变 本课题组前期报道了一遗传性痉挛性截瘫家系患者携带p.S113R突变，经过生物信息学分析发现，该位点及其附近氨基酸在进化上高度保守，且软件预测该突变会引起SLC33A1蛋白跨膜结构域的改变从而影响其正常功能。为了明确p.S113R的致病性及突变性质，我们利用斑马鱼模型进行了以下研究: 1)首先构建了人野生型SLC33A1的表达载体，并采用定点突变的方法获得了携带p.S113R突变的人SLC33A1表达载体，载体质粒经过线性化后经体外转录获得人野生型和突变型SLC33A1 mRNA; 2)通过两种RNA与slc33a1 MO共注射，分析了p.S113R突变的性质。结果显示人野生型SLC33A1 mRNA可以拯救slc33a1 knockdown造成的尾部弯曲和轴突发育的异常，而人突变型SLC33A1 mRNA则没有拯救效果。说明p.S113R是致病突变，另一方面也证实了slc33a1 MO的有效性和特异性; 3)单独注射携带p.S113R突变的人SLC33A1 mRNA，斑马鱼并没有出现明显的发育上异常，提示该突变是一个功能丧失性突变（loss of function）。 第四部分 SLC33A1通过BMP信号通路影响斑马鱼运动神经元轴突生长 近期研究表明BMP(bone morphogenetic protein)信号通路的异常可能是某一类遗传性痉挛性截瘫共同的发病机制。截止目前，已发现4个HSP致病基因编码的蛋白是BMP信号通路的抑制分子，包括NIPA1、ATLASTIN1、SPASTIN和SPARTIN。其中NIPA1和ATLSTIN是通过影响BMP受体到溶酶体的转运来发挥其抑制作用的。同时有研究证实多种神经变性疾病包括肌萎缩侧索硬化、脊髓性肌萎缩和多发性硬化中都存在BMP/TGFβ信号通路的异常，除此之外BMP信号通路在果蝇体内可以调节神经元微管及轴浆运输，在大鼠体内可以抑制脊髓损伤后轴突的再生。说明该信号通路在维持神经元及其轴突稳态中的重要性。鉴于我们观察到slc33a1 knockdown斑马鱼出现轴突截短分又及运动神经元细胞发育异常，在本部分中我们主要探讨SLC33A1是否影响BMP信号通路: 1)采用Western blot方法检测slc33a1 knockdown后多个发育时期斑马鱼(24hpf、36hpf、48hpf和60hpf) BMP信号通路上的关键信号分子磷酸化Smad1/5/8的变化，结果显示显微注射slc33a1 MO后，Smad的蛋白总量并无明显改变，但是磷酸化Smad1/5/8明显上调;同时人野生型SLC33A1 mRNA与slc33a1 MO共注射可以下调slc33a1 knockdown造成的磷酸化Smad1/5/8的升高。说明SLC33A1是BMP信号通路的抑制分子; 2)Dorsomorphin(DM)是一种小分子化合物，可以选择性地抑制BMP受体Ⅰ的激酶活性从而阻断SMAD1/5/8的磷酸化下调BMP信号通路。我们使用不同浓度的DM（3μM，9μM or18μM）处理slc33a1 knockdown斑马鱼，结果发现9μM DM可以显著降低尾部弯曲斑马鱼的比例，减少运动神经元轴突截短和分叉的情况，并明显缓解斑马鱼运动能力低下的表型。以上实验说明Slc33a1可做为BMP信号通路抑制物在斑马鱼运动神经元发育过程中发挥重要作用。 3)在携带SLC33A1基因的p.S113R突

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摘要

符号说明

前言

第一部分 斑马鱼slc33a1基因及其表达分析

材料与方法

结果

讨论

第二部分 Slc33a1 knockdown斑马鱼的表型分析

材料与方法

结果

讨论

第三部分 用斑马鱼模型证实SLC33A1基因p．S113R突变是致病突变

材料与方法

结果

讨论

第四部分 SLC33A1通过BMP信号通路影响斑马鱼运动神经元轴突生长

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

文献综述 斑马鱼在运动神经元疾病研究中的应用

致谢

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