BDNF Val66Met基因多态性与雌性生殖功能的相关性研究

摘要

一、研究背景
　　 脑源性神经营养因子(Brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF)，是神经营养因子家族的重要成员之一。它可以促进中枢神经系统神经元的发育、生长、存活和分化。此外，很多证据表明BDNF在神经元的可塑性及长时程增强等方面发挥着重要作用。近来对于BDNF基因上SNP位点rs6252的研究与日俱增。该突变可导致编码BDNF蛋白基因第66位密码子由缬氨酸(Val)突变为甲硫氨酸(Met)，进而导致BDNF转运障碍和调节性BDNF分泌降低。人群中，携带有Met的杂合子表现为海马容积的减少和海马依赖的学习记忆功能受损，并且与多种神经精神疾病的发生密切相关。
　　 有研究表明BDNF不仅存在于神经系统，也存在于其他多种器官中。近期有研究证明BDNF及其受体TrkB同样出现在卵巢、子宫等女性生殖器官中。使用体外培养卵细胞及转基因小鼠研究发现BDNF对卵细胞的成熟及受精卵的发育有重要作用。对子宫内膜异位所致不孕患者的临床研究也进一步发现，其卵泡液内BDNF的含量明显降低，提示BDNF可能参与女性生殖功能的调控。那么BDNFMet基因变异后是否会增加女性患不孕的风险，其可能的机制又是什么？这成为本实验关注的重点。
　　 为此，本实验收集280例子宫内膜异位症不孕患者，130例单纯输卵管因素所致不孕患者和114例正常怀孕女性为对照，探讨BDNFMet基因多态性对女性生育能力的影响。此外本研究还利用实验室早前构建的BDNFMetknockin小鼠BDNFMet转基因小鼠模型，研究BDNFMet基因多态性对生殖能力的影响及机制。
　　 二、研究目的
　　 1.观察BDNFVal66Met基因多态性与子宫内膜异位所致女性不孕的相关性，及对该类患者IVF治疗效果的影响和可能的机制。
　　 2.观察BDNFVal66Met基因变异雌性小鼠生育能力的改变，并探索其机制。
　　 三、实验方法
　　 1.BDNFVal66Met基因变异在子宫内膜异位症不孕中的作用
　　 1.1人外周血DNA的提取，Real-timePCR基因型鉴定
　　 1.2临床子宫内膜异位患者IVF-ET分析
　　 1.3ELISA检测人血浆和卵泡液中BDNF蛋白含量
　　 2.BDNFVal66Met基因变异降低雌性生殖能力的机制研究
　　 2.1交配实验观察BDNFMet/Met基因型小鼠的生殖能力
　　 2.2小鼠动情周期的检测
　　 2.3通过石蜡包埋、切片观察小鼠卵巢中各种卵泡数及子宫内膜是否产生病理性变化
　　 2.4卵巢、子宫HE染色
　　 2.5ELISA测下丘脑和垂体、卵巢、子宫的BDNF蛋白浓度
　　 2.6促排卵试验观察小鼠对激素的反应能力
　　 四、实验结果
　　 1BDNFVal66Met基因变异在子宫内膜异位症不孕中的作用
　　 1.1BDNFVal66Met变异增加子宫内膜异位症女性不孕的发生
　　 对正常生育女性、输卵管因素不孕女性及子宫内膜异位症不孕女性行BDNFMet基因型鉴定，发现子宫内膜异位症不孕女性BDNFMet/Met基因型(32.5％)和Met等位基因频率(57.1％)分别较其它两组明显增高(P=0.043,P=0.015)，提示BDNFVal66Met变异可能是导致子宫内膜异位症女性不孕的危险因素之一。
　　 1.2BDNFVal66Met变异降低不孕患者IVF治疗效果
　　 所收集的子宫内膜异位症不孕患者和输卵管因素不孕患者中分别有198名和102名行IVF-ET治疗，我们将其按BDNFMet基因型分别分为三组。在子宫内膜异位症不孕患者中，携带BDNFMet/Met的患者较BDNFVal/Val携带者使用了更高剂量的Gn(P＜0.01)，但却获得更少的成熟卵(P＜0.01)、更低的受精率(P＜0.05)和更少的高质量胚胎(P＜0.05)。此外，输卵管因素不孕患者中也发现了类似的现象:在输卵管阻塞病相关不孕的病人中BDNFMet/Met基因型的人群相比于BDNFVal/Val基因型人群，这些指标也呈现相似的差异:在更高剂量的Gn(P＜0.01)下有更少的成熟卵(P＜0.05)和更低的受精率(P＜0.01)。
　　 1.3BDNFVal66Met变异降低IVF患者卵泡液中BDNF含量
　　 在对上述行IVF治疗的病人取卵时，分别抽取静脉血和卵泡液，用ELISA方法检测BDNF蛋白的含量。结果发现，不论是子宫内膜异位症不孕患者还是输卵管因素不孕患者，BDNFMet/Met携带者较BDNFVa/Val携带者卵泡液中BDNF蛋白水平明显下降(P＜0.05)，而血浆中BDNF含量不受影响。
　　 2BDNFVal66Met基因变异降低雌性生殖能力的机制
　　 2.1BDNFMet/Met基因型小鼠相对于野生型小鼠的生殖能力减弱。
　　 选取10周龄不同BDNF基因型的雌性小鼠分别与野生型雄鼠交配，结果显示BDNFMet/Met基因变异雌性小鼠的生育率较BDNFVal/Val雌鼠明显降低(P＜0.05)，每胎产仔数也略有降低但没有统计学差异，提示BDNFMet/Met变异会影响雌性小鼠的生殖能力。
　　 2.2BDNFMet/Met基因型小鼠的动情周期变化。
　　 分别取10周和28周大的BDNFVal/Val、BDNFMet/Met雌鼠测量动情周期。发现10周时两组小鼠都呈现正常的动情周期，但28周时，BDNFMet/Met小鼠动情周期呈现出不规律性，具体表现在动情间期时间较BDNFVa/Val明显延长(P＜0.05)，动情期持续时间显著减少(P＜0.01)。
　　 2.3BDNFMet/Met基因变异影响卵泡成熟。
　　 分别取3周、10周的BDNFMet/Met和BDNFVal/Val小鼠卵巢，经石蜡切片和HE染色等步骤，统计卵巢中各级卵泡数目。结果发现:3周龄BDNFMet/Met雌鼠的窦前卵泡(PF)、窦状卵泡(A)、闭锁卵泡数(AF)与野生型小鼠相比无统计学差异;而10周龄BDNFMet/Met基因型小鼠的黄体、窦状卵泡数目减少(P＜0.05)，与此同时，闭锁卵泡数目却显著增加(P＜0.05)。这提示BDNFMet/Met变异小鼠生殖能力的减弱并不是由于原始卵泡的数量受到影响，而是由于卵泡从窦前卵泡发育为成熟卵泡的过程受到了影响。
　　 2.4BDNF蛋白在下丘脑垂体、卵巢中的含量减少，而子宫内的含量不变。
　　 分别取10周BDNFMet/Met和BDNFVal/Val小鼠下丘脑、卵巢和子宫，利用ELISA试剂盒，测组织中BDNF蛋白水平。与BDNFVal/Val小鼠相比，BDNFMet/Met变异可导致下丘脑和卵巢中BDNF的含量显著减少(P＜0.05)。但在子宫内BDNF蛋白水平无明显改变(P＜0.05)。
　　 2.5BDNFMet基因变异降低小鼠对促排卵药物的反应
　　 我们通过对3周的不同基因型小鼠腹腔注射PMSG（促进卵泡生长的一种性激素），48h后腹腔注射hCG（促进排卵的一种性激素），16h后处死小鼠并从壶腹部取卵，镜下数出排卵个数。我们发现，BDNFMet/Met基因型小鼠对激素的反应能力下降(P＜0.05)。
　　 五、实验结论
　　 1、BDNFVal66Met基因变异与子宫内膜异位症女性不孕的发生密切相关，并且该变异还能导致患者对IVF治疗的反应性明显降低，这可能和卵泡液中BDNF的含量降低有关。
　　 2、BDNFMet/Met基因型雌鼠呈现出低生育能力的表型。该表型的发生与BDNFMet/Met小鼠卵巢中卵泡的发育不良有关，同时下丘脑及卵巢中BDNF含量的降低也可能会通过影响性激素的分泌造成不孕的发生。BDNFMet/Met小鼠对促排卵药物的反应性明显降低，这与人类临床表型是相似的。