VEGFR-2细胞膜色谱法的建立及药物筛选应用

摘要

研究背景:肿瘤的发生发展是一个非常复杂的过程，肿瘤血管不仅为肿瘤细胞的生长输送营养，并且也是肿瘤生长、浸润和转移的主要途径，而肿瘤血管生成又受多种因子影响。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）是最重要的血管生成因子，作为血管内皮细胞特异的有丝分裂原，它直接参与了血管形成这个过程，促进内皮细胞分裂增殖，促使新生血管生成，同时还可有效地提高血管的通透性。VEGF这一功能是通过和其特异性受体结合来发挥作用的。VEGF受体家族主要包括三个成员:VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)、VEGFR-3(Flt-4)，它们都属于受体酪氨酸激酶(RTK)Ⅲ型超家族。研究表明VEGFR-2(KDR/Flk-1)在调节内皮细胞增殖、分化反应中最为重要，是内皮细胞VEGF信号转导的主要执行者，VEGF与KDR结合使受体二聚体化，进一步激发KDR酪氨酸发生磷酸化，导致自身酶活性和下游信号相关酶类的激活，从而调节血管内皮细胞相关反应。新生血管的形成对恶性肿瘤的生长是必不可少的因素，因而以KDR为靶点进行药物筛选成为抗肿瘤血管生成的重要方略。
　　 目前存在的筛选VEGFR-2抑制剂的方法以检测酶活性为主，但是一些传统方法如酶谱分析法、免疫分析法、放射性配基法等存在不可避免的缺点，不适合大量、多组分化合物的筛选。与此同时，组合化学技术大大加快了药物及其先导化合物的合成速度，所以，建立一个简便快速的筛选平台势在必行。
　　 鉴于以上原因，本文建立了VEGFR-2细胞膜色谱法，并应用于一系列VEGFR-2小分子抑制剂的初步药理活性筛选。
　　 实验方法:本实验对比选择了硅胶、壳聚糖/二氧化硅(CTS/SiO2)、海藻酸钠/二氧化硅(ALG/SiO2)载体材料制备细胞膜固定相用于建立VEGFR-2细胞膜色谱。
　　 本文制备了两种有机无机复合载体材料分别为CTS/SiO2和ALG/SiO2。首先本工作对壳聚糖的脱乙酰度和SiO2的硅羟基含量进行了测定，制备CTS/SiO2复合材料采用环氧氯丙烷修饰的SiO2颗粒，SiO2颗粒表面的硅烷醇羟基基团和较大的表面积使其能和环氧氯丙烷充分反应，得到功能化的羟丙基氯化的SiO2颗粒，再交联固定在壳聚糖上形成CTS/SiO2复合材料，采用L18(37)正交试验考察了制备工艺中的催化剂的量、反应时间、反应温度，考察指标为复合材料中壳聚糖含量。ALG/SiO2利用海藻酸钠在二价钙离子的存在下可使海藻酸交联的特性，将SiO2颗粒分散至海藻酸钠溶液中，并将其滴入CaCl2溶液中形成海藻酸钙/SiO2水凝胶，经过固化洗涤后形成ALG/SiO2复合材料，实验中考察了海藻酸钠和SiO2加入的比例以及CaCl2溶液的浓度。并利用扫描电子显微镜、红外光谱、热重分析、元素分析等对两种杂化材料进行表征，采用固定化明胶酶的方法考察不同载体的生物相容性，并计算酶的特征参数——Km。
　　 本工作第二项重要内容是高表达VEGFR-2细胞的筛选与细胞膜制备，通过流式细胞术对待筛的几种肿瘤细胞进行细胞表面VEGFR-2抗原测定，选出高表达VEGFR-2受体的人脑胶质瘤细胞，并通过差速离心获取活性和纯度较好的细胞膜，考察了细胞膜获取的破碎方式、离心速度、温度对细胞膜蛋白和活性的影响。然后将细胞膜吸附融合在载体材料表面，制成细胞膜固定相，考察了细胞膜和载体的配比等因素，确定最优的实验方案，并考察不同载体对固载细胞膜蛋白的量和ATP酶活性的影响。
　　 筛选抑制剂:以上市药物sunitinib为阳性对照，用以上建立的方法测定其在VEGFR-2细胞膜色谱柱上的保留，验证模型的可靠性，并考察精密度。分别进样新合成的10种邻氨基苯甲酰胺类的VEGFR-2小分子抑制剂，考察各化合物在柱上的保留时间和容量因子，将两种不同的色谱固定相的筛选结果进行对照，并与MTT法筛药结果进行比较。
　　 实验结果:CTS/SiO2的最佳反应条件为:70℃反应4h，催化剂为0.10g;扫描电镜结果分析为壳聚糖交联的团状SiO2颗粒;红外光谱可明显看出壳聚糖和SiO2的特征峰;热重分析表明，杂化材料的热性能略有降低，与物理混合物有明显区别;元素分析可明显看出杂化材料中壳聚糖的质量分数为37.3％。ALG/SiO2杂化材料制备工艺中海藻酸钠和SiO2的最优比例为1∶2，CaCl2溶液的最佳浓度为1.0mol/L;扫描电镜分析其形态为不规则形SiO2包埋穿梭与海藻酸钙网状结构中;红外光谱也可看出海藻酸钠和SiO2的特征峰;热重分析表明杂化材料的热性能提高了;元素分析可明显看出杂化材料中海藻酸钠的质量分数为30.9％。两种材料对明胶酶的键合量和Km与硅胶相比，硅胶固载酶量为4848±80U/g，Km为0.33±0.0015，CTS/SiO2固载酶量为5094±59U/g，Km为0.075±0.00018，ALG/SiO2固载酶量为5388±21U/g，Km为0.035±0.00019。
　　 流式细胞仪筛选的VEGFR-2表达量最高的肿瘤细胞是U251人脑胶质瘤细胞，在4℃条件下，采用细胞超声破碎仪破碎细胞，先低速离心(600g)10min，再高速离心(14000g)25min收集细胞膜，细胞膜与载体的最佳比例为2×106/0.01g。
　　 细胞膜色谱法测定的阳性药sunitinib的保留时间最长，且稳定性和重复性都较好，MTT法也可证实其IC50为760nM，表明筛选模型是可行的。对另外10个化合物，三种细胞膜色谱法和MTT比色法测定结果整体趋势保持一致，其与细胞膜结合的活性均较阳性药差别较大，但总体上药物在硅胶细胞膜色谱上的保留时间略微偏长，CTS/SiO2细胞膜色谱法筛选效果最好。
　　 结论:本文分别选用SiO2、CTS/SiO2、ALG/SiO2细胞膜固定相建立VEGFR-2细胞膜色谱的筛选方法是可行的，能够实现对大量多组分化合物快速筛选。