新型转录抑制因子ZHX1对肝癌细胞系生长的抑制作用

摘要

目的:探讨新型转录抑制因子ZHX1抑制肝癌细胞系生长的作用，为研究肝脏特异性基因表达调控机制和寻找新的肝癌临床检测指标奠定基础。
　　 方法:1.构建融合表达载体pEGFP—ZHX1、pcDNA-ZHX1，并用荧光显微镜和Westernblot方法检测ZHX1蛋白水平的表达。
　　 2.由博尚生物技术工程公司设计并合成了针对ZHX1cDNA序列的寡核苷酸，退火后克隆入含有H1启动子的pSilencerTM3.构建针对ZHX1的siRNA表达载体ps1554，重组子经测序鉴定。pcDNA—ZHX1分别与ps1554，阴性对照(negativecontr01)和pSilencer3.1空质粒共转染7701细胞，并设立空细胞对照组，48h后，Westernblot分析细胞中ZHX1蛋白的表达情况，从而检测siRNAs的干扰作用。
　　 3.肝癌细胞系7701、7402中过量表达ZHX1:pcDNA—ZHX1质粒(lug)转染肝癌细胞系7701、7402，做生长曲线。同时48h后收集细胞蛋白Westernblot分析细胞中ZHX1蛋白的表达情况。4.肝癌细胞系7701、7402中抑制ZHX1表达:ps1554质粒(lug)转染肝癌细胞系7701、7402，做生长曲线。同时48h后收集细胞蛋白Westernblot分析细胞中ZHX1蛋白的表达情况。5.检测肝癌组织标本中ZHX1的表达:分别用RT-PCR和Real-TimePCR检测肝癌组织和癌旁组织中ZHX1表达的情况。
　　 结果:1.成功构建融合表达的载体pE6FP-ZHX1、pcDNA—ZHX1。阳性重组子质粒抽提后分别进行连接后单、双酶切、PCR、DNA测序分析鉴定，证明重组载体pEGFP-ZHX1、pcDNA—ZHX1构建成功。转染7701细胞后48h，Westernblot和荧光显微镜分别检测到融合基因的表达，其中pEGFP—ZHX1转染组，绿色荧光明显集中在细胞核内，提示ZHX1具有核定位的能力，符合转录因子的特点。
　　 2.ZHX1蛋白抑制肝癌细胞系生长。转染pcDNA—ZHX1质粒(lug)的肝癌细胞系7701、7402生长受到抑制，而转染针对ZHX1的SiRNAs表达载体ps1554质粒(lug)肝癌细胞系7701、7402的生长速度加快。
　　 3.检测肝癌组织标本中ZHX1的表达。12组肝癌标本RT-PCR检测显示ZHX1在癌旁组织中的表达高于癌组织中的表达。10组肝癌标本Real-TimePCR显示7组癌旁组织中ZHX1表达高于癌组织中的表达。
　　 结论:本研究成功构建了可以在体外有效表达ZHX1融合蛋白的表达载体pEGFP—ZHX1和pcDNA—ZHX1，为进一步研究ZHX1的功能提供了必要的条件。生长曲线的方法证实了7701和7402两种肝癌细胞系中ZHX1高表达抑制细胞系的生长;反之，利用siRNA干扰后两种细胞系中的ZHX1，可促进细胞生长。提示ZHX1可抑制肝癌细胞系的生长。RT-PCR，Real-TimePCR对于肝癌标本的检测显示ZHX1对于肝癌的生长具有抑制作用。

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材料和方法

一、材料

二、方法

结果

讨论

附图

附录

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致谢

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