鸟氨酸脱羧酶(ODC)及转录因子RUNX3在胃癌中表达失调的分子机制研究

摘要

胃癌是世界范围内的高发恶性肿瘤，其发病率居各种恶性肿瘤第二位，仅次于肺癌;其致死率占癌症相关死亡率的第二位。中国是胃癌高发病率的国家，世界卫生组织报告显示中国每年新发胃癌患者占世界胃癌发病人数的42％。由于缺乏有效的早期诊断分子标志而导致胃癌的早期诊断困难，多数患者初诊时已是胃癌晚期失去手术机会;另外胃癌对现有的放化疗不够敏感，因而胃癌的预后不佳，文献报道胃癌患者的五年生存率只有24％。因此，深入研究胃癌发生发展的分子机制是寻找有效的诊断标志和改进治疗方案的根本。
　　 恶性肿瘤的标志是无限的细胞增殖。影响细胞增殖的因素包括两类，即促进增殖的正调控因素和抑制增殖的负调控因素，它们共同作用于细胞周期、细胞增殖与分化、细胞凋亡等相关基因。正常情况下，二者力量的平衡使细胞处于可控的正常生长状态;二者力量的失衡将导致上述基因表达的失调使细胞生长失控而诱发癌症。鸟氨酸脱羧酶(ODC)是催化多胺生物合成的第一个关键酶，能促进细胞增殖，与肿瘤发生密切相关;RUNX3是重要的调节胃上皮细胞生长的转录因子，可以抑制细胞周期进行、促进细胞凋亡而发挥抑制细胞增殖的作用。为进一步解析胃癌的发病机制，本文深入研究了ODC和RUNX3在胃癌发生中表达失调的分子机制，以期为胃癌的防治提供理论支持和指导。
　　 第一部分
　　 H.pylori毒力因子CagA激活Src/MEK/ERK/c-Myc信号通路上调鸟氨酸脱羧酶(ODC)表达参与胃癌发生
　　 幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，H.pylori)的感染可以诱发胃癌已经得到公认，其感染首先诱发胃炎，慢性炎症的长期刺激使细胞过度增殖而促进胃癌发生。H.pylori的毒力因子众多，与胃癌发生关系最密切的是细胞毒素相关基因A（cytotoxin-associatedgeneA，cagA）。研究报道慢性胃炎和胃癌患者中ODC酶活性升高，H.pylori感染阳性的慢性胃炎患者较阴性患者ODC酶活性升高，但分子机制不明;成纤维细胞中c-Myc可以转录激活ODC表达，胃上皮细胞中尚不清楚二者的关系。为此，本课题深入探讨了胃上皮细胞中ODC的表达是否受H.pylori及其毒力因子CagA调节，c-Myc是否发挥作用，以及ODC对胃癌细胞增殖能力的影响。
　　 目的:
　　 探讨ODC在H.pylori感染后表达上调的分子机制及其在胃癌发生中的作用。
　　 方法:
　　 (1)免疫组化检测慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎和原发性胃癌患者临床标本中的ODC和c-Myc蛋白表达，将免疫组化结果量化后用SPSS软件进行相关性分析。
　　 (2)用不同的H.pylori菌株（cagA野生株和突变株）以100∶1（细菌与细胞数之比）感染胃癌细胞AGS及胃上皮永生化细胞GES-1，Westernblot检测ODC蛋白表达的变化。将野生型CagA真核表达质粒（pcDNA3.1-WT-cagA）转染AGS、GES-1和胃癌细胞BGC-823，24h后收集细胞，分别用QRT-PCR和Westernblot检测ODCmRNA和蛋白的表达，同时检测c-myc基因表达变化。
　　 (3)构建野生型ODC基因启动子的荧光素酶报告基因质粒（包含2个c-Myc结合元件），双酶切和DNA测序鉴定正确后以其为模板构建c-Myc结合元件缺失的ODC基因启动子荧光素酶报告基因质粒，并用双酶切和DNA测序鉴定。将野生型和突变型ODC基因启动子的荧光素酶报告基因质粒分别与pcDNA-3.1-WT-cagA共转染细胞，检测荧光素酶报告基因的活性变化。
　　 (4)构建c-mycsiRNA表达质粒（pSUPER-c-myc），DNA测序正确后将其转染BGC-823细胞抑制c-Myc蛋白表达，再转染pcDNA3.1-WT-cagA，Westernblot检测ODC蛋白表达的变化。
　　 (5)用特异性信号蛋白抑制剂预处理细胞（PP1阻断Src家族激酶活性，PD98059抑制MEK1激酶活性，LY294002阻断PI3K激酶活性，BAY11-7082抑制NF-κB活性），再转染pcDNA3.1-WT-cagA;另外将突变型CagA表达质粒（pcDNA3.1-PR-cagA）转染细胞。24h后收集细胞用Westernblot检测ODC蛋白表达的变化。
　　 (6)先用表达GFP的ODCantisenseRNA腺病毒感染BGC-823细胞48h，再用H.pylori感染细胞2h，胰酶消化细胞并计数，进行克隆形成实验。
　　 结果:
　　 (1)免疫组化检测结果显示慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎和胃癌患者中ODC蛋白表达水平和阳性率依次增高，伴有肠化生的慢性胃炎患者均有ODC表达。
　　 (2)H.pylori26695感染GES-1细胞0、1、2、4、8h后ODC蛋白表达呈时间依赖性上调，NCTC11637菌株感染GES-1细胞4h后也诱导ODC蛋白表达上调，用两种菌株分别感染AGS细胞同样诱导ODC蛋白表达上调。而cagA基因敲除的H.pylori26695感染细胞则不能诱导两种细胞中的ODC蛋白表达上调。
　　 (3)将pcDNA3.1-WT-cagA分别转染AGS、BGC-823和GES-1后，ODCmRNA和蛋白表达均呈现明显上调。双荧光素酶报告基因分析结果显示，CagA能够增强野生型ODC基因启动子介导的荧光素酶活性。
　　 (4)c-mycmRNA和蛋白表达在CagA转染的细胞中出现同步上调，将慢性胃炎和胃癌标本中c-Myc和ODC的免疫组化结果量化后进行统计学分析，显示二者表达密切相关(ρ=0.635，p＜0.001)。双荧光素酶报告基因分析结果显示CagA不能增强c-Myc结合元件缺失的ODC基因启动子介导的荧光素酶活性，转染pSUPER-c-myc抑制胃癌细胞中c-Myc蛋白表达后可以取消CagA诱导的ODC蛋白表达上调。
　　 (5)特异性信号蛋白抑制剂处理细胞后用Westernblot检测ODC蛋白表达，发现PP1、PD98059、LY294002和BAY11-7082均可以抑制CagA诱导的ODC蛋白表达上调，转染pcDNA3.1-PR-cagA（表达的CagA蛋白不能被细胞内蛋白激酶磷酸化）则不能诱导ODC蛋白表达上调。
　　 (6)用ODCantisenseRNA抑制细胞内ODC蛋白表达后，能够明显削弱胃癌细胞在感染H.pylori前后的克隆形成能力。
　　 结论:
　　 (1)ODC蛋白参与胃癌发生过程，肠化生与ODC蛋白表达密切相关。
　　 (2)野生型和突变型ODC基因启动子的荧光素酶报告基因质粒和c-mycsiRNA表达质粒构建成功。
　　 (3)H.pylori诱导ODC蛋白表达上调依赖其毒力因子CagA的表达，CagA通过增强ODC基因启动子的转录活性诱导ODC基因表达。
　　 (4)c-Myc结合序列对于CagA增强ODC启动子活性是必需的，细胞内c-Myc蛋白是CagA诱导ODC蛋白上调必需的。
　　 (5)Src，MEK，PI3K和NF-κB信号途径参与CagA诱导的ODC蛋白表达上调，CagA以磷酸化形式发挥诱导作用。
　　 (6)降低ODC蛋白水平削弱胃癌细胞在感染H.pylori前后的克隆形成能力。
　　 第二部分
　　 miR-532-5p负性调节RUNX3表达促进胃癌细胞增殖
　　 RUNX3以转录因子的方式调节多种基因表达最终抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制癌细胞转移而发挥肿瘤抑制因子的作用。研究表明，由于基因启动子过度甲基化、等位基因的杂合性缺失和RUNX3蛋白在细胞浆的滞留使得RUNX3在许多人类原发性胃癌中失活。尽管如此，部分胃癌患者出现RUNX3表达下调，却缺乏上述失活机制的存在，表明有其他因素调控RUNX3的表达。近年来，miRNA的发现及其研究领域的兴起开启了RUNX3表达下调机制研究的新篇章。本课题从转录后调控水平(miRNA)出发，探讨了miRNA-532-5p调节胃上皮细胞中RUNX3表达的分子机制，以及miR-532-5p对胃癌细胞生物学功能的影响。
　　 目的:
　　 探讨胃癌中miR-532-5p调节RUNX3表达的分子机制，以及miR-532-5p对胃癌细胞生物学功能的影响。
　　 方法:
　　 (1)QRT-PCR和Westernblot检测7种胃癌细胞和胃上皮永生化细胞GES-1的miR-532-5p、RUNX3mRNA和蛋白表达。蛋白检测结果量化后，用SPSS软件对miR-532-5p与RUNX3mRNA、蛋白表达的相关性进行分析。
　　 (2)构建miR-532-5p真核表达质粒（pSilencerTM4.1-CMV-532），双酶切和DNA测序鉴定正确后将其转染胃癌细胞和胃上皮永生化细胞。同时将miR-532-5p特异的mimics和inhibitor分别转染细胞，QRT-PCR和Westernblot检测miR-532-5p、RUNX3蛋白的表达，同时检测RUNX3靶分子p21和Bim蛋白的表达。
　　 (3)构建包含miR-532-5p结合序列的RUNX33'UTR的荧光素酶报告基因质粒（pMIR-REPORTTM-RUNX3WTUTR，野生型），双酶切和DNA测序鉴定正确后以其为模板构建miR-532-5p结合序列突变的RUNX33'UTR荧光素酶报告基因质粒（pMIR-REPORTTM-RUNX3MutUTR，突变型），双酶切和DNA测序验证突变序列。
　　 (4)将miR-532-5p特异的mimics分别与野生型和突变型RUNX33'UTR的荧光素酶报告基因质粒共转染细胞，同时转染pMIR-REPORTTM-β-galControl质粒校正因转染效率所致差异。48h后收集细胞检测荧光素酶报告基因的表达活性及β-galactosidase活性。
　　 (5)将miR-532-5p特异的mimics转染BGC-823细胞，AnnexinV/PI双荧光染色检测细胞凋亡，PI染色检测细胞周期。
　　 结果:
　　 (1)胃癌细胞和胃上皮永生化细胞中miR-532-5p、RUNX3mRNA及蛋白的检测结果显示，miR-532-5p在AGS、KATO-Ⅲ和NUGC-3中表达水平最高，但这三种细胞中RUNX3表达缺失;BGC-823、GES-1、SGC-7901和MKN-45中RUNX3表达水平较高，而miR-532-5p表达水平较低。将蛋白检测结果量化后用SPSS软件进行相关性分析。分析结果显示，miR-532-5p与RUNX3mRNA及蛋白表达呈负相关，相关系数分别为-0.738和-0.776，具有统计学意义(p＜0.05)。
　　 (2)双酶切和DNA测序验证pSilencerTM4.1-CMV-532均正确，QRT-PCR检测结果显示，4种转染细胞内的miR-532-5p表达明显上调，质粒构建成功。
　　 (3)将miR-532-5pmimics转染BGC-823、GES-1和SGC-7901细胞，miR-532-5p表达水平明显上升，而RUNX3蛋白表达则明显下降。转染pSilencerTM4.1-CMV-532也可以抑制RUNX3蛋白的表达，但抑制效果不如转染mimics明显。相反，转染inhibitor后细胞内miR-532-5p表达水平下降，RUNX3蛋白表达则升高。
　　 (4)单荧光素酶报告基因活性分析结果显示，miR-532-5p的表达可以明显降低野生型RUNX33'UTR介导的荧光素酶活性，而对突变型RUNX33'UTR介导的荧光素酶活性没有影响。
　　 (5)Westernblot检测结果显示，miR-532-5pmimics可以明显下调RUNX3靶分子p21和Bim蛋白的表达，而miR-532-5pinhibitor则可以上调p21和Bim蛋白表达。流式细胞学检测结果显示，miR-532-5pmimics减少胃癌细胞的凋亡比例，减少G1期、增加G2-M期细胞的比例。
　　 结论:
　　 (1)在胃癌及胃上皮永生化细胞中miR-532-5p可以负性调节RUNX3蛋白表达。
　　 (2)三个质粒pSilencerTM4.1-CMV-532，pMIR-REPORTTM-RUNX3WTUTR和pMIR-REPORTM-RUNX3MutUTR均构建成功。
　　 (3)miR-532-5p通过其种子序列直接作用于RUNX33'UTR发挥负调控作用，RUNX3是miR-532-5p调控的直接靶分子。
　　 (4)miR-532-5p通过降低RUNX3靶分子p21和Bim蛋白的表达减少细胞凋亡，加快细胞周期进行，因而增加胃癌细胞的生存，促进胃癌细胞的增殖。

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摘要

符号说明

第一部分 H．pylori毒力因子CagA激活Src／MEK／ERK／c-Myc信号通路上调鸟氨酸脱羧酶(ODC)表达参与胃癌发生

前言

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

5．创新点与局限性

参考文献

第二部分 miR-532负性调节RUNX3表达促进胃癌细胞增殖

前言

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

5．创新点与局限性

参考文献

致谢

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