血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大的内质网应激机制研究

摘要

心肌肥大是由缺血、机械牵张、激素和细胞因子等因素引起的心肌细胞代偿性反应，主要表现为细胞体积增大、重量增加以及间质细胞增生，其过程中必然伴随着钙稳态的失衡、蛋白质合成速率增加以及细胞凋亡。心肌肥大失代偿时出现心力衰竭，严重危及人类生命。因此阐明心肌肥大的发病机制具有重要的临床意义。
　　 内质网(endoplasmicreticulum，ER)是细胞内重要的亚细胞器，参与蛋白质合成、折叠、钙的储存和释放，还参与脂类代谢、类固醇代谢的合成，对维持心肌细胞钙离子和蛋白质合成稳态具有重要作用。缺血缺氧、葡萄糖/营养物质匮乏、ATP耗竭、大量自由基的产生及Ca2+稳态破坏等应激刺激均可引起内质网功能障碍，触发内质网应激(ERstress，ERS)。适度的ER应激有利于细胞内钙和蛋白质加工等稳态的恢复，增强细胞耐受应激刺激的能力;持续而严重的ER应激则促进CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-bindingprotein-homologousprotein，CHOP)和Caspase-12等内质网凋亡通路激活，触发ER应激相关的凋亡信号通路，导致细胞凋亡。ER应激感受蛋白——蛋白激酶R样ER激酶(proteinkinaseR-likeERkinase，PERK)是位于内质网膜上的Ⅰ型跨膜蛋白激酶。正常状态下，PERK与GRP78结合成无活性的复合物;当发生ER应激时，GRP78与未折叠蛋白或错误折叠蛋白结合，同时与PERK解离，使其寡聚化并激活，进而磷酸化真核细胞起始因子2α(eukaryoticinitiationfactor2α，eIF2α)，下调mRNA和蛋白的转录翻译水平，减轻ER蛋白负荷。持续的激活PERK/eIF2α信号通路将上调CHOP的转录翻译水平，最终引起细胞凋亡，是介导ER应激整合调控反应的重要细胞内信号途径之一。
　　 既往研究证实ER应激与心血管疾病、神经退行性变、糖尿病和缺血/再灌注损伤等多种疾病密切相关。研究证实心肌肥大时ER应激标志性分子葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulatedprotein78，GRP78)、钙网蛋白(calreticulin，CRT)表达明显上调，提示ER应激参与了心肌肥大的过程。本课题组前期研究证实，ER应激诱导剂毒胡萝卜素(thapsigargin，TG，抑制ER钙泵继而排空ER内Ca2+)和衣霉素（tunicamycin，TM，抑制ER内蛋白质N-端糖基化）不仅可以诱导心肌细胞发生显著的ER应激，并直接诱导心肌细胞肥大。牛磺酸(Taurine，Tau)是体内含量最丰富的含硫自由氨基酸，具有稳定细胞膜、调节细胞Ca2+稳态和清除氧自由基等多种生物学效应。研究证实牛磺酸可以抑制Hcy等多种因素诱导的ER应激，增强内质网的蛋白质折叠能力并且减少修饰异常，对心肌细胞具有保护作用。血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）是一类可以引起剧烈缩血管效应的活性多肽是目前最常用的诱导实验性心肌细胞肥大的物质之一，其致心肌细胞肥大的机制尚未完全阐明，我们认为PERK介导的ERS可能是AngⅡ致心肌细胞肥大的机制。
　　 本工作在原代培养的乳大鼠心肌细胞AngⅡ诱导心肌细胞肥大模型上，研究ERS应激分子GRP78、CRT以及PERK途径相关分子表达的变化，进一步研究内质网应激抑制剂牛磺酸对于AngⅡ诱导心肌细胞肥大以及该过程中内质网应激的影响。主要实验方法和结果如下:
　　 1血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大
　　 本部分实验在原代乳鼠心肌细胞模型上，观察AngⅡ和ER应激诱导剂对心肌细胞肥大的影响。采用不同浓度AngⅡ（10-7mmol/L、10-6mmol/L、10-5mmol/L）作用于心肌细胞48h;同时采用不同浓度TG（10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L）作用于心肌细胞48h;另外采用不同浓度TM（1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml）作用于心肌细胞72h。采用RT-PCR技术观察心肌细胞肥大标志性基因心房钠尿肽（atrialnatriureticpeptide,ANP）和脑钠肽(brainnatriureticpeptide，BNP)mRNA表达，[3H]-亮氨酸([3H]-Leucine)掺入技术测定心肌细胞蛋白质合成速率，分析心肌细胞表面积变化，同时分析细胞凋亡率变化。
　　 结果发现，10-7mmol/LAngⅡ组、50nMTG组和10ng/mlTM组诱导ANP和BNPmRNA表达显著上调，蛋白质合成速率和细胞表面积明显增加，并且心肌细胞凋亡率较低。上述结果提示AngⅡ和ER应激诱导剂可以诱导原代乳鼠心肌细胞发生显著肥大。
　　 2血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大过程中ERS相关分子表达变化
　　 CRT、GRP78是ER应激的标志性分子，而PERK/eIF2α信号途径是ER应激的重要信号通路之一。本部分实验在原代乳鼠心肌细胞肥大模型上，通过检测AngⅡ和ER应激诱导剂对心肌细胞ER应激相关分子表达的影响，探讨PERK介导的ERS在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大过程中的作用。采用10-7mmol/LAngⅡ作用于心肌细胞48h、50nMTG作用于心肌细胞48h以及10ng/mlTM作用于心肌细胞72h。分别采用RT-PCR和qPCR技术检测ER应激相关分子CRT、GRP78、PERK、eIF2α和CHOPmRNA表达，Westernblot技术检测CRT、GRP78、PERK、eIF2α和CHOP蛋白水平改变。
　　 结果发现，AngⅡ组、TG组和TM组CRT、GRP78、PERK、eIF2α和CHOPmRNA和蛋白水平表达明显增加，提示AngⅡ和ER应激诱导剂诱导心肌细胞发生明显ER应激，并且PERK/eIF2α信号途径参与了心肌细胞的肥大过程。证实内质网应激是血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大的重要机制之一。
　　 3牛磺酸通过抑制ERS减轻血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大
　　 上述研究结果表明内质网应激是血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大的重要机制之一，既往研究表明牛磺酸(Taurine，Tau)可以对心肌缺血、心力衰竭、心肌缺血再灌注损伤及心律失常起保护作用。本部分实验在原代乳鼠肥大心肌细胞肥大模型上，研究牛磺酸对AngⅡ诱导心肌细胞肥大过程中ERS分子的变化及其与心肌细胞肥大的关系。在AngⅡ、TG、TM诱导的肥大心肌细胞模型组中分别加入40mMTau作为牛磺酸保护组。采用RT-PCR技术检测ANP和BNPmRNA表达，[3H]-亮氨酸掺入技术测定心肌细胞蛋白质合成速率，同时分析心肌细胞表面积变化。采用RT-PCR和qPCR技术检测ER应激相关分子CRT、GRP78、PERK、eIF2α和CHOPmRNA表达，Westernblot技术检测CRT、GRP78、PERK、eIF2α和CHOP蛋白水平改变。
　　 结果显示，牛磺酸减轻AngⅡ、TG和TM引起的心肌细胞ANP和BNPmRNA表达上调、蛋白质合成速率和细胞表面积的增加。牛磺酸还下调AngⅡ、TG和TM引起的心肌细胞ER应激分子mRNA和蛋白水平表达。提示牛磺酸通过抑制ER应激，减轻血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大。
　　 实验结论如下:ER应激是AngⅡ致心肌细胞肥大的机制之一。牛磺酸通过抑制ER应激，减轻血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大

材料与方法

实验结果

讨论

附图表

参考文献

第二部分 血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞过程中ERS相关分子表达变化

材料与方法

实验结果

讨论

附图

参考文献

第三部分 牛磺酸通过抑制ERS减轻血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大

材料与方法

实验结果

讨论

附图

参考文献

结论

致谢

硕士在读期间发表论文

学位论文评阅及答辩情况表