小分子类肽氨肽酶N(APN/CD13)抑制剂的设计、合成及初步活性研究

摘要

目的:氨肽酶N(APN/CD13)，是一类锌离子依赖性的膜结合Ⅱ型金属蛋白酶，广泛地分布于哺乳动物的小肠、肾脏、肝脏以及中枢神经系统中，参与了营养素的最终水解以及生物活性分子如脑啡肽和内啡肽的降解。此外，APN也是冠状病毒入侵的受体，并参与了抗原递呈的过程。更为重要的是，相比于正常细胞，APN在许多肿瘤细胞表面高水平表达，被称作为肿瘤细胞标记物，在恶性肿瘤的生长、侵袭、转移以及肿瘤新血管生成等过程中发挥着重要的作用。因此，APN已经成为抗肿瘤药物研究的一个重要靶点。
　　 目前，研究报道的APN抑制剂主要有天然产物以及化学合成小分子两大类。天然产物主要包括:Bestatin、Amastatin、Lapstatin、Probestin、Leuhistin、AHPA-Val、PsammaplinA、Betulinicacid等;化学合成小分子主要有:β-氨基硫醇类、α-氨基醛类、α-氨基磷酸类、AHPA类、L-异谷氨酸类、α-氨基硼酸类、环酰亚胺类、L-赖氨酸衍生物类、氯霉胺衍生物类以及黄酮-8-乙酸衍生物类等。但到目前为止，只有Bestatin是唯一一个已经上市的APN抑制剂，临床上主要用于急性非淋巴性白血病的辅助治疗。Bestatin作为天然产物，来源有限，除了对APN有抑制作用外，对体内其他酶如:APB，LAP等也具有较强的抑制作用，这就需要通过药物化学的方法来寻找和开发具有高选择性和低毒性的APN抑制剂。
　　 方法:本研究以APN为靶标，通过对其活性位点结构分析以及在实验室前期工作的基础上，通过合理药物设计，引入了类肽的药物设计原则，设计、合成了环酰亚胺类、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸衍生物类、3-苯基异丝氨酸衍生物类和L-苯甘氨酸衍生物类四个系列共94个小分子类肽化合物，并对其进行了初步的体外抑制APN和MMP-2酶活、抗肿瘤细胞增殖、体外抑制血管生成以及小鼠体内抑制黑色素瘤B16BL6细胞肺转移实验等，以期找到具有良好APN抑制活性的化合物。
　　 结果:本研究共设计、合成了四个系列94个小分子类肽化合物，并对所合成的目标化合物通过电喷雾质谱以及核磁共振氢谱等方法进行了结构确证，经查阅文献证实，所合成的目标化合物均为新型化合物，未见文献报道。
　　 初步的体外抑酶活性实验结果显示，在A系列化合物中，大部分化合物都表现出较好的APN抑制活性，其中化合物7c活性最好，IC50值达到5.00μM，与阳性对照Bestatin(IC50=4.18μM)相当。在B系列化合物中，我们引入了具有构象限制的Tic结构片段，相比于A系列化合物而言，本系列化合物活性并没有明显提高，只有化合物23h，结构中含有的苯甘氨酸羟肟酸残基，可能与APN活性位点能更好匹配，化合物活性最好，IC50值达到6.28μM，与阳性对照Bestatin(IC50=5.55μM)很接近;另外，化合物结构中含有苯丙氨酸、酪氨酸以及蛋氨酸羟肟酸残基时，活性也较好，如:化合物23i、23j、23k等。在C系列化合物的设计过程中，我们引入了与AHPA具有类似结构的3-苯基异丝氨酸片段，但体外抑酶活性结果显示本系列化合物对APN抑制活性普遍较差，只有结构中含有羟肟酸基团的化合物，如:30a，30b和30e等活性较好，其中化合物30e活性最好，IC50值达到1.26μM，比阳性对照Bestatin(IC50=2.55μM)活性要好。由于B系列和C系列中活性最好的化合物23h和30e结构中都含有苯甘氨酸羟肟酸残基，我们推测苯甘氨酸片段可能与APN活性位点空腔能更好地匹配，于是，我们保留苯甘氨酸及羟肟酸部分，同时将苯甘氨酸的氨基与不同的芳酸或取代芳酸连接，设计、合成了D系列化合物。体外抑酶活性结果显示，本系列化合物活性普遍较好，IC50值在1.36-19.94μM之间，其中化合物38d活性最好，IC50值为1.36μM，要优于阳性对照Bestatin(IC50=6.40μM)。
　　 在体外抗肿瘤细胞增殖实验中，通过MTT法测定了部分体外抑酶活性较好的化合物对肿瘤细胞HL-60，ES-2，MDA-MB-231以及小鼠黑色素瘤B16BL6等细胞的生长抑制作用，结果显示体外对APN抑制作用较强的化合物，对APN表达量相对较高的肿瘤细胞，如:HL-60，ES-2和B16BL6细胞等同样具有较高的增殖抑制活性;化合物30e和38d对ES-2和B16BL6肿瘤细胞的生长抑制活性优于阳性对照Bestatin，其中化合物38d活性最好。
　　 体外人脐静脉内皮细胞成管腔实验和大鼠主动脉环微血管生成实验结果显示化合物30e和38d均具有显著的体外抑制血管生成作用，其中化合物38d抑制大鼠主动脉环微血管生成的活性最好，在200μmol/L浓度时大鼠动脉环周围几乎看不到微血管生成。
　　 在抑制小鼠黑色素瘤B16BL6肺转移实验中，在100mg/kg/d剂量下，化合物30e和38d均能显著抑制小鼠黑色素瘤B16BL6细胞的肺转移，抑制率分别为35.59％、46.89％(其中阳性对照Bestatin的抑制率为33.33％)。
　　 结论:本研究基于大肠杆菌APN的晶体结构及其抑制剂Bestatin与活性位点的结合模式，在实验室前期工作基础上，设计、合成了四个系列共94个目标小分子类肽化合物。通过初步的体外及体内生物活性评价，我们发现了几个具有进一步研究开发价值的化合物，如:化合物30e和38d等，并进一步对其进行了以分子对接为主的构效关系研究，探讨了其与APN活性位点的结合模式，为今后新型小分子类肽APN抑制剂的设计、合成奠定了基础。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

1．1．氨肽酶N的结构特征、组织分布以及生物学功能

1．1．1．氨肽酶N的结构特征

1．1．2．氨肽酶N的组织分布

1．1．3．氨肽酶N的生物学功能

1．2．氨肽酶N抑制剂的研究进展

1．2．1．天然产物来源的APN抑制剂

1．2．2．化学合成小分子类APN抑制剂

参考文献

第二章 目标化合物的合理设计与合成

第一节 目标化合物的合理设计

2．1．APN抑制剂的设计原则

2．2．A系列(环酰亚胺类)APN抑制剂的合理设计

2．3．B系列(1，2，3 4-四氢异喹啉-3-羧酸衍生物类)APN抑制剂的合理设计

2．4．C系列(3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酸衍生物类)APN抑制剂的合理设计

2．5．D系列(L-苯甘氨酸衍生物类)APN抑制剂的合理设计

第二节 目标化合物的化学合成

2．6．A系列化合物的合成

2．7．B系列化合物的合成

2．8．C系列化合物的合成

2．9．D系列化合物的合成

参考文献

第三章 目标化合活性评价

3．1．体外抑酶活性实验

3．1．1．目标化合物抑制氨肽酶N活性实验

3．1．2．目标化合物抑制明胶酶活性实验

3．1．3．实验结果

3．1．4．部分目标化合物对人卵巢癌细胞ES-2以及小鼠黑色素瘤细胞B16BL6细胞表面APN的抑酶活性测试

3．2．部分目标化合物对不同肿瘤细胞株的体外抗增殖实验

3．2．1．实验原理

3．2．2．材料与方法

3．2．3．实验结果

3．3．目标化合物初步体外抑制血管生成实验

3．3．1．目标化合物抑制人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)成管腔实验

3．3．2．目标化合物抑制大鼠主动脉环微血管生成实验

3．4．目标化合物抑制小鼠黑色素瘤B16BL6细胞肺转移实验

3．4．1．实验原理

3．4．2．材料和方法

3．4．3．实验结果

参考文献

第四章 目标化合物的构效关系研究

4．1．材料与方法

4．2．确定对接条件

4．3．目标化合物的分子对接结果分析

4．4．讨论

参考文献

第五章 总结与展望

5．1．总结

5．2．展望

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录

附录Ⅰ 部分化合物的ESI-MS，HRMS，1H-NMR图谱

附录Ⅱ 外文文章

学位论文评阅及答辩情况表