酸性氨基酸在多肽质谱裂解中作用的研究

摘要

经过科学家的不懈努力，上世纪90年代初提出的人类基因组计划基本完成，目前已进入了后基因组学时代，蛋白质组研究就是其中很重要的内容。要进行该研究，就需要测定每一个蛋白质中的氨基酸序列组成、结构和功能。
　　 近年来随着蛋白质组学研究技术的飞速发展，生物质谱技术已成为蛋白质的氨基酸序列组成的测定和结构研究中一种不可或缺的鉴定技术。利用质谱对相关蛋白质进行序列测定，需先将蛋白质用蛋白酶酶解（如胰蛋白酶可水解Lys或Arg的-C端形成的肽键）成肽段，之后对这些肽段进行鉴定与分析。虽然，科学家已经建立了多肽质谱数据库，但在现实的测定与分析中，时常会遇到一些强的碎片峰并非常规的离子，无法用常规的质谱裂解碎片进行归属，酸性氨基酸在多肽质谱裂解中的作用机理尚未阐明。因此，对多肽分门别类，研究某一类多肽的裂解情况，以便为进一步完善多肽质谱数据库，为拓宽质谱技术在多肽及蛋白质组学研究中的应用提供参考依据与理论支持。
　　 本论文选取了含酸性氨基酸的多肽，分别通过氧化、改变氨基酸的种类或位置来研究酸性氨基酸在多肽裂解中的作用，同时还研究了含酸性氨基酸多肽发生氮端乙酰化与碳端酰胺化修饰前后的多肽裂解差异。在质谱实验中，分别通过质谱裂解效率曲线及二级质谱图等手段，评价了多肽酸性氨基酸变化及端点修饰前后多肽裂解的差异;在量子化学计算中，研究了多肽酸性改变及端点修饰前后主链酰胺键上相关原子电荷分布的变化情况;将实验结果和理论计算的电荷分布相关联，探讨了酸性氨基酸在多肽质谱裂解过程中的作用。论文主要包括以下三个部分的研究内容:
　　 第一部分:以含易被氧化氨基酸——半胱氨酸的多肽作为研究对象，通过质谱与量子化学计算来探讨氧化前后多肽裂解效率的变化情况。质谱试验结果表明，含半胱氨酸的多肽氧化后，其加氧产物均比原肽容易裂解，且氧化程度越深（即酸性越强），越容易裂解。量子化学计算所得到的电荷分布结果也证实了这一点，对于多肽RGDC，随着氧化程度的加深，作为主要断裂位点的第三个酰胺键上QO/QN值则一直增大，这说明加氧后酰胺键的氮原子对质子的吸引力要比氧原子对质子的吸引力变得更强，从而使促使多肽更加容易裂解;对于GRCG及其衍生物，随着氧化程度的加深，酰胺键上QH/Q(O+N)值一直减小，这表明质子更容易流动到酰胺键上，促进了裂解反应的发生。
　　 第二部分:以质谱实验及量子化学计算方法为研究手段，研究了多肽特定位置处氨基酸种类改变(样品多肽为LAXSV，X=D、E、C)或多肽中同一氨基酸位置改变(此处研究的氨基酸为谷氨酸，分别为ELASV、LEASV、LAESV、LASEV及LASVE)前后多肽裂解情况的变化。质谱试验结果表明，特定位置氨基酸由天冬氨酸→谷氨酸→半胱氨酸过程中，多肽变得难裂解;谷氨酸位置由氮端逐渐移动到碳段过程中，多肽也变得更难裂解。同样在电荷分布方面，特定位置氨基酸由天冬氨酸→谷氨酸→半胱氨酸过程中，酰胺键上QN值越来越大，这表明质子更难流动到酰胺键的氮原子上;而谷氨酸位置由氮端逐渐移动到碳端过程中，酰胺键上QO/QN值逐渐变小，从这可以看出与氧原子相比，质子更难流动到酰胺键的氮原子上，上述两种情况下都会使多肽变得更加难以裂解。
　　 第三部分:通过对多肽端点进行修饰——氮端乙酰化与碳端酰胺化，以质谱实验与量子化学计算为平台，研究上述情况下多肽裂解的变化情况。本部分研究的多肽主要是氮端乙酰化与碳端酰胺化前后的GRCG及LAXSV(X=D、E、C)。
　　 研究表明，经氮端乙酰化修饰后，多肽变得更加容易裂解;而当碳端酰胺化后，多肽的裂解未有变化或变得更加困难。而上述结论也得到酰胺键上电荷分布情况变化的有力支持，氮端乙酰化修饰后的多肽其酰胺键上QN增大，表明氮原子变得更加容易吸引质子，从而促进了多肽的裂解;而碳端酰胺化后的多肽酰胺键上QN则未有变化或减小，表明氮原子吸引质子的能力未有改变或变得更难吸引质子，从而使多肽裂解情况未有变化或更难裂解。
　　 本论文的研究成果表明，氧化条件下，多肽中酸性的增强可以使质子更容易流动到酰胺键上或其氮原子上，从而促进多肽的裂解;而直接改变氨基酸种类时，酸性的增强使酰胺键上氮原子更加排斥质子，酰胺键变得更难裂解;谷氨酸位置从氮端移动到碳端时，质子更难流动到酰胺键氮原子上，使多肽更难裂解;氮端乙酰化可以促进多肽的裂解，而碳端酰胺化则与之相反。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1 前言

2 氨基酸及多肽

2．1 氨基酸

2．2 多肽

3 质谱简介

3．1 质谱仪组成

3．2 质谱仪分类

3．3 质谱仪的应用

4 量子化学简介

4．1 量子化学研究范围

4．2 量子化学理论方法

4．3 量子化学的应用

5 论文的研究背景及研究内容、研究意义

5．1 多肽裂解简介

5．2．研究内容

5．3．研究意义

第二章 氧化改变多肽酸性

1 引言

2 实验部分

2．1 实验试剂

2．2 实验仪器

2．3 实验方法

3 结果与讨论

3．1 RGDC情况讨论

3．2 GRCG及其衍生物情况讨论

4 结论

第三章 氨基酸种类及位置改变

1 引言

2 实验部分

2．1 实验试剂

2．2 实验仪器

2．3 实验方法

3 结果与讨论

3．1 特定位置氨基酸种类改变

3．2 同一氨基酸位置改变

4 结论

第四章 多肽修饰

1 引言

2 实验部分

2．1 实验试剂

2．2 实验仪器

2．3 实验方法

3 结果与讨论

3．1 GRCG及其衍生物

3．2 LAXSV(X=D、E、C)及其氮端乙酰化产物

4 结论

第五章 全文总结和研究展望

1 主要结论

1．1 氧化改变多肽酸性

1．2 氨基酸种类及位置改变

1．3 多肽修饰

2 研究展望

参考文献

硕士期间参与完成的科研项目

硕士期间参与的基金项目

硕士研究生期间发表学术论文目录

致谢

学位论文评阅及答辩情况表