核苷(酸)类似物相关乙型肝炎病毒逆转录酶耐药突变分析及rtA181耐药突变的个体化再治疗

摘要

背景:乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus，HBV)感染是一个世界性的公共卫生问题，同时HBV也是慢性乙型肝炎(chronic hepatitisB，CHB)及肝硬化患者疾病进展的重要因素，故抗病毒治疗是治疗的关键。目前国际公认的两类有效的抗病毒药物分别是干扰素（interferon，IFN）和核苷（酸）类似物[nucleos(t)ideanalogues，NUCs]。NUCs抑制HBV复制疗效确切可靠，可降低或阻止肝硬化及原发性肝癌的发生;但随着治疗时间延长，NUCs可导致HBV耐药突变的发生，从而引起肝炎发作。因此，在HBV感染者的治疗中，定期检测，尽早发现NUCs相关的HBV耐药，并及时给予有效的挽救治疗具有重要意义。焦磷酸测序是一种新型的DNA测序技术，可快速准确的定量检测HBV逆转录区的多个耐药位点，且与直接测序法符合率高。
　　 目的:研究在NUCs抗病毒治疗中，采用焦磷酸测序法检测HBV逆转录区NUCs相关10个耐药位点，并分析其突变情况，即突变位点、突变模式及相互关系;rtA181耐药突变的既往用药、临床特征及个体化再治疗的疗效。
　　 方法:采用焦磷酸测序法对180例慢性HBV感染者的HBV逆转录区10个耐药突变位点(rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtT184G、rtA194T、rtS202I、rtM204V/I、rtN236T、rtM250V)进行定量检测。分别总结耐药突变位点与拉米夫定（lamivudine，LAM）、阿德福韦酯(adefovir dipivoxil，ADV)、恩替卡韦(entecavir，ETV)、替比夫定(telbivudine，LdT)之间的关系。其中54例CHB及相关肝硬化患者，在NUCs治疗中病毒学突破并检出rtA181突变，检测其血清HBVDNA、HBsAg定量及ALT水平，焦磷酸基因测序法定量检测HBV的逆转录区10个NUCs相关耐药突变位点。回顾性分析不同用药史患者的病毒变异模式，比较病毒学突破时与基线、rtA181单个与多个位点变时的HBVDNA载量，分析发生病毒学突破时，含rtA181T与含rtA181V位点突变患者的血清学指标。前瞻性队列研究分析不同个体化干预措施的疗效。正态分布的计量资料用t检验进行比较，不符合正态分布的数据用Mann-Whitney检验分析，两组间计数资料的比较采用x2检验或Fisher's确切概率法。
　　 结果:①NUCs治疗过程的耐药突变模式:71例拉米夫定(LAM)相关耐药出现4个耐药突变位点呈10种耐药突变模式，以rtM204位点多见，rtM204V突变均伴有rtL180M联合突变;35例ADV相关耐药检出2个突变位点6种突变模式，以rtA181位点为多见，可联合rtN236T突变;40例替比夫定(LDT)相关突变出现4个耐药突变位点呈6种突变模式，均含有rtM204I突变位点;11例恩替卡韦(ETV)相关耐药突变出现7个耐药位点呈6种耐药突变模式，在M204V联合L180M基础上，以rtT184L突变多见。
　　 ②54例rtA181突变的患者中，35例(64.8％)为包含rtA181T的突变。既往用药主要为ADV和LAM。应用多种NUCs者，多位点突变占57.6％(19/33);单一NUCs者，多位点突变占28.6％(6/21)，x2=4.342，P＜0.05。
　　 ③rtA181突变的患者发生病毒学突破时，患者血清HBVDNA载量较初次NUCs抗病毒治疗时低[(5.66±1.01)log10拷贝/ml比（6.75±0.81）log10拷贝/ml，t=-4.210，P＜0.01]，含rtA181T位点突变患者较含rtA181V位点突变患者乙型肝炎表面抗原（hepatitisBsurfaceantigen，HBsAg）水平高[（3.80±0.45）log10IU/ml比（3.46±0.60)log10IU/ml,t=2.109,P＜0.05]。
　　 ④对rtA181突变的患者分别给予加用或换用恩替卡韦和加用替比夫定治疗，随访满24周时，HBVDNA≥6log10拷贝/ml的患者中，8例加用或换用恩替卡韦，4例加用替比夫定，其发生病毒学应答者分别为8例和3例，HBVDNA阴转者分别为3例和1例;HBVDNA＜6log10拷贝/ml中，14例加用或换用恩替卡韦，7例加用替比夫定，其发生病毒学应答者分别为14例和5例，HBVDNA阴转者分别为12例和4例。
　　 结论:①长期应用NUCs治疗的慢性HBV感染者，可于逆转录区筛选出NUCs相关HBV耐药。LAM相关耐药突变以M204为主，其中rtM204V突变均伴有rtL180M联合突变;ADV相关耐药突变以rtA181突变为主、ETV相关耐药突变均在M204+rtL180M存在的基础上、以联合rtT184L突变为主;LDT相关突变中均存在rtM204I。rtA181是LAM与ADV的交叉耐药位点。
　　 ②用药史与rtA181突变模式有一定关系，应用多种NUCs的患者，易出现多位点突变和多重耐药。
　　 ③对rtA181耐药突变的患者，加用或换用恩替卡韦干预治疗的疗效好于加用替比夫定方案。