两种小GTP酶Rab4b,Rab32及蛋白激酶C delta(PKCδ)在棉铃虫变态过程中的功能研究

摘要

研究背景：
　　 昆虫是地球上种类最多，数量最大的生物种群，与人类有着密不可分的关系。昆虫的发育是由激素调控的复杂的生命过程，包括昆虫的蜕皮与变态。在全变态昆虫中，蜕皮过程包括幼虫之间的蜕皮，幼虫到蛹的蜕皮以及蛹到成虫的蜕皮。幼虫向蛹的转变被称为变态。昆虫的变态是受蜕皮激素(20E)和保幼激素(JH)共同调控的。在幼虫期，20E引发蜕皮，JH负责维持个体的幼虫状态;而在幼虫的末龄期，JH滴度逐渐降低甚至消失，20E则起始变态过程。目前对于20E及JH协调调控变态的机制已经有了比较深入的研究。但最近的研究表明，除了20E与JH两种激素外，胰岛素(insulin)在昆虫的变态中起着不可忽视的作用。研究发现，insulin与20E存在着相互作用，二者共同的调控昆虫的生长及变态决定。但二者相互作用的分子机制尚不清楚，有哪些分子参与了两个通路的相互作用，还有待进一步研究。
　　 昆虫的变态过程中伴随着组织的重建，例如，中肠和脂肪体。在变态时期，幼虫的组织要发生解体，成虫的组织重新形成，这一过程也是由20E与JH共同调控的。20E诱导程序性细胞死亡使幼虫组织降解，而JH则拮抗20E的功能。然而，组织的重建过程是一个复杂的生理过程，除了激素的调控外，还依赖于其他的活性分子。但目前对于参与组织重建效应分子的研究还不深入。小GTP酶Rab蛋白在哺乳动物中广泛参与了各种生理活动，包括膜泡运输，细胞骨架活性及信号转导等生理过程，但在昆虫发育过程中对于该类蛋白的研究还很有限。此外，蛋白激酶C作为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶可以通过促进底物蛋白磷酸化调节多种生理过程，如细胞生长与增殖，细胞凋亡等。有研究发现蛋白激酶C参与昆虫20E信号转导过程，但哪种蛋白激酶C参与20E的信号转导还有待研究。
　　 存在的科学问题：
　　 本实验室通过对棉铃虫变态期转录组进行测序，鉴定到两种小GTP酶Rab4b，Rab32及一种蛋白激酶Cdelta(PKCδ)基因。拟解决的科学问题为:Rab4b，Rab32是否参与由激素调控的变态过程？在功能上有何差异？PKCδ是否参与20E调节的变态及其伴随的组织重建过程？
　　 研究意义：
　　 本研究通过鉴定三种参与变态过程的关键分子，阐明了不同分子的具体功能，从分子水平上揭示激素调控变态的分子机制，为进一步研究昆虫发育提供依据。此外，本研究通过鉴定参与组织重建的效应分子，丰富了我们对于组织重建机制的认识和理解，为农业害虫的防治提供了理论指导。
　　 研究方案及取得的成果：
　　 本文以鳞翅目昆虫，棉铃虫，为实验材料，通过体内，体外的干扰实验及激素调控实验来探索两种Rab蛋白Rab4b，Rab32及蛋白激酶Cdelta(PKCδ)在昆虫变态及组织重建中的功能。所得实验结果如下:
　　 1.Rab4b参与insulin与20E信号通路的基因转录进而调控糖原水平及变态发生
　　 本研究在棉铃虫鉴定到一个小GTP酶Rab4b参与了20E与胰岛素调控的基因转录。该基因在表皮、中肠、脂肪体及血淋巴中均有表达。虫体RNA干扰导致幼虫在化蛹前死亡，异常化蛹及小蛹的形成。生化分析结果显示，干扰Rab4b后，糖原的储存水平下降;体内及体外干扰实验表明，20E通路中的Br和HR3以及糖原合成酶GS的转录水平受到抑制，而FOXO的转录水平上调。免疫细胞化学及免疫印迹的结果表明，insulin通过Rab4b抑制FOXO的核定位，过表达Rab4b进行亚细胞定位检测，发现insulin没有影响Rab4b定位，而20E刺激后Rab4b向细胞膜迁移。但在mRNA水平上，20E不影响Rab4b的表达，而胰岛素则诱导Rab4b的上调。暗示20E与胰岛素信号通路通过不同的方式来调控Rab4b，最终调控变态的发生。
　　 2.Rab32参与棉铃虫变态期中肠的重建
　　 我们从棉铃虫中肠中鉴定到Rab32基因。半定量RT-PCR分析Rab32表达模式发现该基因在预蛹期的中肠mRNA水平最高。20E诱导Rab32上调，而JH类似物(JHA)不影响其转录。在表皮细胞系中干扰20E核受体EcR-B1后，20E对Rab32的上调作用消除。免疫细胞化学结果显示，该蛋白主要位于细胞质中，而20E使Rab32在细胞系中聚集颗粒状结构并增加Rab32在细胞质中的蛋白表达。免疫组织化学结果显示，在变态期的中肠中，Rab32定位与成虫中肠上皮细胞的内部边缘位置，暗示其可能参与中肠形成中营养的吸收及信号转导的作用。在虫体内干扰Rab32后，幼虫的生长及变态没有受到影响，但成虫中肠的形态发生异常。这些结果说明Rab32参与了棉铃虫变态期的中肠重建，Rab32可能在20E信号途径的调控下参与成虫中肠的形成。
　　 3.蛋白激酶Cdelta(PKCδ)参与棉铃虫变态期组织的解体
　　 本研究在棉铃虫中发现了一个新型的蛋白激酶C，PKCδ，参与了变态期中肠和脂肪体的凋亡。PKCδ在棉铃虫的表皮、中肠、脂肪体中均有表达，且在变态期转录水平较高。体内注射激素实验结果显示，20E和JHⅢ都可以上调PKCδ的转录，。在细胞系上干扰EcR-B1后，20E不能上调PKCδ,而干扰JH的候选受体Met后，JHⅢ对PKCδ的诱导作用没有变化，说明20E通过EcR-B1周控PKCδ,而JHⅢ可能通过其他的方式，而不是Met来调控PKCδ转录。在虫体中干扰PKCδ,中肠和脂肪体无法进行解体和重建;凋亡相关基因Caspase8的表达被抑制，而凋亡抑制因子Survivin转录上调。在表皮细胞中过表达PKCδ的功能域，可以诱导细胞凋亡，并增强了FOXO的核定位，说明PKCδ可能通过调节FOXO的转录活性诱导凋亡。在表皮细胞中干扰PKCδ,抑制了20E及JHⅢ对USP1，Calponin等关键基因的上调作用，说明PKCδ可能参与了20E与JH的信号转导途径的相互作用。
　　 所取得成果的创新点与意义：
　　 本文主要通过体内及体外的RNA干扰技术，鉴定到一个小GTP酶Rab4b通过调控20E与胰岛素通路基因转录及糖原合成进而参与变态。深入揭示了20E通路与胰岛素通路相互作用的机制。同时，我们鉴定到另一种小GTP酶Rab32参与了中肠重建中成虫中肠的形成，丰富了小GTP酶Rab蛋白在昆虫中的功能研究。此外，发现蛋白激酶Cdelta(PKCδ)参与了20E诱导的组织凋亡及20E与JH对下游基因的调控，本研究为深入揭示昆虫变态的激素调控及组织重建的分子机制提供了依据。

目录

声明

摘要

缩写说明

第一章 前言

第一节 昆虫蜕皮和变态的分子机制

一．蜕皮激素信号转导

二．保幼激素信号途径

三．胰岛素信号转导途径

第二节 昆虫变态时期的组织重建

一．中肠的重建及激素调控

二．脂肪体的重建

第三节 RabGTP酶与蛋白激酶C

一．Rab蛋白

二．蛋白激酶C

第四节 本论文的科学问题研究方案与意义

第二章 Rab4b通过调节20E及insulin通路基因转录及糖原水平参与变态过程

一．前言

二．材料与方法

1．材料

2．方法

三．实验结果

1．Rab4b的全长克隆及序列分析

2．Rab4b在棉铃虫不同组织的不同发育阶段均有转录

3．虫体干扰Rab4b导致幼虫变态异常

4．干扰Rab4b降低了虫体内糖原储存

5．干扰Rab4b抑制了20E通路及insulin途径中的基因转录

6．Rab4b调控20E通路及insulin途径的基因转录

7．Rab4b参与insulin调控的FOXO细胞质定位

8．Rab4b通过不同的定位参与20E及insulin通路调控

9．Insulin促进Rab4b的转录，而20E不影响Rab4b转录

10．Rab4b的转录依赖于葡萄糖

四．讨论

第三章 Rab32参与棉铃虫变态期的中肠重建

一．前言

二．材料与方法

1．材料

2．方法

三．实验结果

1．Rab32的基因克隆和序列分析

2．Rab32的重组表达及抗体特异性检测

3．Rab32在变态期表皮和中肠高表达

4．20E上调Rab32的转录

5．20E通过EcR-B1上调Rab32的转录

6．20E诱导Rab32在细胞质中聚集

7．Rab32定位于成虫中肠的上皮细胞

8．干扰Rab32阻碍成虫中肠的形成

9．干扰Rab32破坏精巢细胞骨架

四．讨论

第四章 蛋白激酶C delta参与棉铃虫变态期组织的解体

一．前言

二．材料与方法

1．材料

2．方法

三．实验结果

1．PKCδ部分cDNA序列

2．PKCδ在棉铃虫变态期高表达

3．PKCδ转录可以被20E和JHⅢ诱导上调

4．20E通过EcR-B1诱导PKCδ的上调

5．干扰PKCδ抑制凋亡阻止变态过程

6．过表达PKCδ功能域诱导表皮细胞的凋亡

7．过表达PKCδ功能域增强FOXO的核定位

8．干扰PKCδ抑制USP1，Kr-H1及Calponin的转录

9．PKCδ结构域的重组表达与纯化

四．讨论

论文创新点总结与讨论

一．本研究阐明了Rab4b在insulin与20E调控下参与棉铃虫变态过程

二．本研究证明了Rab32参与变态期组织重建过程中成虫中肠的形成

三．本研究发现了PKCδ在20E的调控下参与变态期组织解体

参考文献

致谢

在读期间发表论文和准备发表文章

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