蛋白磷酸酶6L(PP6)和瘦素受体叠加转录蛋白(LepROT)在棉铃虫变态和发育中的功能研究

摘要

一、研究背景及研究意义
　　 分子生物学技术的发展给昆虫学研究带来广阔的前景。人类研究昆虫，可以为害虫防治提供可供参考的理论依据。昆虫生长发育中要经历特征明显的蜕皮和变态过程，其中不仅需要蜕皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)和保幼激素(juvenilehormone，JH)的综合调控，现在的研究也证明了胰岛素途径和FoxO可以参与昆虫发育调控过程。不同的信号调控途径相互作用，共同实现对昆虫的控制。在昆虫的信号调控中，既存在着昆虫特异的蜕皮和保幼激素调控途径，又有着真核生物中比较保守的胰岛素和FoxO信号途径。阐明这些激素或蛋白的功能，不仅对昆虫的生长发育和蜕皮变态的分子机理有重大意义，而且可以为害虫防治提供理论依据。
　　 二、国内外研究进展以及存在的科学问题
　　 1.昆虫中20E和JH相互作用，共同调节昆虫的生长发育。20E负责起始昆虫各龄期幼虫之间的蜕皮和末龄时期向蛹的转化，JH则协调控制20E调节的各项生理活动，共同参与调控蜕皮和变态过程。目前国内外对20E信号通路的研究比较详尽，20E信号调控途径比较清晰;相反，JH的研究相对较少，还不能确定JH的受体，其信号转导途径也不清楚。20E信号途径与JH信号途径的相互作用了解的也比较少。昆虫变态时会有一些列形态和组织结构的变化。其中研究较多的是唾液腺和中肠的重建。昆虫中肠重建的过程包括幼虫中肠的凋亡解体和成虫中肠的分化形成。磷酸酶如何参与调控蜕皮激素诱导的变态时期中肠的凋亡是本论文的研究重点。
　　 2.昆虫的发育还受到FoxO的调节。FoxO是许多基因转录的调控开关。伴随FoxO的磷酸化去磷酸化以及与DNA的解离与结合，可以关闭或启动某些基因的表达，从而诱导产生不同的生理反应。FoxO作为一个调控多种信号通路的中心分子，在生物体的生命活动中占据重要的位置。我们发现一个瘦素受体叠加转录基因。该基因是维持生物体正常的发育所必需的，并且对FoxO具有调控作用。该基因如何调控FoxO，影响昆虫的发育，也在本论文中有所涉及。
　　 三、研究方法与取得的成果
　　 本文利用鳞翅目昆虫棉铃虫（Helicoverpaarmigera）的表皮细胞系实验平台以及虫体实验平台，运用分子生物学和细胞生物学技术，研究了棉铃虫PP6基因如何通过参与20E信号转导和PCD信号调控棉铃虫的生长发育和中肠的凋亡;研究了LepROT对昆虫发育的影响以及在胰岛素信号通路中的作用和对FoxO的影响，取得如下结果:
　　 1.20E可以上调PP6的表达从而影响变态时期中肠的PCD过程
　　 程序性细胞死亡(programmedcelldeath，PCD)在变态时期的昆虫中肠中起着重要的作用。20E可以推动PCD的进行。我们鉴定得到了一个蛋白磷酸酶6(Proteinphosphatase6，PP6)同中肠的PCD有关。中肠中，该基因可以通过20E的受体EcR1在变态时期被蜕皮激素诱导上调，保幼激素不能上调PP6的转录;干扰PP6基因可以影响变态时期中肠的PCD过程;PP6对PCD的调节被证明是通过20E通路中的E75b和HR3，以及凋亡相关的基因E93，Broad，E74a，rpr和caspase实现的。这些结果说明，PP6可以调控20E信号途径，并且可以参与中肠的PCD过程。
　　 2.LepROT可以通过影响PI3K和FoxO调控昆虫的发育
　　 LepROT是持家表达的基因，不受蜕皮和保幼激素的调控，也不受胰岛素的调控。干扰LepROT以延缓昆虫的发育。LepROT可以调节FoxO的表达和定位。在正常的情况下，FoxO主要表达在细胞质中。当在细胞系中干扰LepROT时，FoxO在细胞质和细胞核中都有表达，但是更多的表达在细胞核中。在细胞系中过表达LepROT，FoxO的表达将受到抑制。这些结果说明，LepR对昆虫发育的调控是通过FoxO实现的。
　　 四、结论及意义
　　 本文运用分子生物学和细胞生物学实验方法，研究了棉铃虫发育过程中PP6和LepROT的功能。发育中关于蛋白激酶的研究很多，但是关于磷酸酶的研究相对较少。本论文首先阐明了磷酸酶在昆虫变态时期调控PCD的作用，并揭示了PP6通过20E信号途径和凋亡相关基因控制中肠在变态时期的凋亡。首次研究了一个瘦素受体叠加转录蛋白，并揭示了该蛋白在昆虫发育过程中的作用。本论文为揭示昆虫发育与变态的分子机理提供了理论基础，为研究人类健康与疾病的生理机制提供了参考和思路。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

第一节 昆虫的蜕皮变态及其分子机制

一、概述

二、蜕皮激素转导途径

第二节 激素诱导的程序性细胞死亡

一、概述

二、昆虫中肠的重建和程序性细胞死亡

三、参与中肠PCD的基因

第三节 FOXO和瘦素受体叠加转录蛋白

一、FOXO

二、瘦素和瘦素受体叠加转录蛋白

第四节 胰岛素信号途径

一、胰岛素和昆虫中的胰岛素样多肽

二、胰岛素信号转导途径

第五节 存在的科学问题、研究方案及研究意义

第二章 磷酸酶6(PP6)在昆虫变态时期中肠凋亡过程中的功能研究

一．前言

二．材料与方法

1．材料

2．实验方法

三．实验结果

1．PP6是一个在各个物种中比较保守的蛋白

2．PP6在变态时期的中肠和脂肪体中的转录水平是上调表达的

3．蜕皮激素20E能诱导PP6的表达

4．20E对PP6的上调作用是通过它的受体EcRB1实现的

5．PP6参与中肠变态时期的程序性细胞死亡

6．PP6参与了昆虫20E信号转导途径

7．干扰PP6会抑制参与中肠PCD的基因的表达

四．讨论

1．PP6参与了20E信号转导途径

2．PP6是中肠PCD途径基因转录所必需的

3．PP6参与了中肠变态时期的PCD过程

第三章 LepROT在昆虫发育中的功能研究

一．前言

二．材料和方法

1．材料

2．实验方法

三．实验结果

1．LepROT的序列及相似性分析

2．LepROT是持家表达的基因，不受蜕皮激素、保幼激素和胰岛素的调控

3．干扰LepROT可以延缓昆虫的发育

4．干扰LepROT可以抑制FoxO由细胞核转移至细胞质

5．过表达LepROT可以抑制FoxO的表达

四．讨论

1．LepROT可以从定位和表达上调节FoxO蛋白

2．LepROT对FoxO表达量的调节可能是通过蛋白转运实现的

参考文献

论文创新点总结

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

学位论文评阅及答辩情况表