中药体外致突变性高通量检测方法的探索

摘要

在细菌抗药性成为全球性难题之际,中药成为后抗生素时代解决细菌抗药性的重要资源,不仅成为中国中长期科技发展纲要中的主要内容之一,也引起世界范围内的广泛关注。因而,中药的安全性也受到越来越多的关注。
　　鉴于中药的使用方法目前仍然主要沿用中医师药方(多种中药饮片的组合)—水煎液口服的服用模式,因此要关注中药的安全性,首先要关注中药饮片的安全性,其次才是复配过程的安全性。尽管中药的使用具有悠久的历史,但是目前国内尚没有完善的中药饮片安全性数据库,因而建立类似的数据库就显得尤为重要。因此,本课题从如何修正和建立适合中药饮片的体外致突变检验的方法入手,利用微生物检测的方法对中药遗传毒理学尤其是体外致突变性进行初步的评价,希望逐步建立常用中药饮片和复方的体外致突变性数据库,为中药的安全性提供参考数据。
　　药品的安全性评价程序包括急性毒性检测、遗传毒性检测(包括致突变性)、亚慢性毒性和慢性毒性检测四个阶段。之所以要对中药的体外致突变性进行检测,是因为体外致突变性检测是唯一能用微生物手段进行检测的指标,而且有大量的数据表明,待测物的致突变性和致癌性之间存在一定的相关性。因此,致突变性检验成为国际上公认的致畸和致癌检验的初筛方法。针对中药的特殊性质,做了如下工作:
　　1.体外致突变检测的方法有很多,其中最经典也是最为常用的是细菌回复突变实验(Ames试验),该方法在检测中药体外致突变过程中存在一些不足之处,比如检测结果会受样品中组氨酸成分的影响等。针对中药的特殊性本实验室对Ames试验进行了修正,通过添加过量的组氨酸以掩盖样品中微量组氨酸带来的影响,并用预培养的方法替代平板掺入法,简化了操作,修正后的Ames试验克服了中药中组氨酸成分的影响。国家标准采用统一的预培养时间且处理时间短(90min),事实上不同的待测物可能需要的预培养时间不一样,因此需要找到一个合适的预培养时间,能够使不同待测物的致突变性充分发挥出来。此外,Ames试验操作复杂,不适合对大量中药进行快速的评价,因此本课题的主要内容是寻找高通量的体外致突变检测方法以替代经典Ames试验。之所以对Ames试验进行修正,是因为该方法具有可参考的标准,能够作为其他方法的一个参考。
　　2.从上世纪80年代开始,经典Ames试验的替代方法层出不穷,这其中应用最多也是和Ames试验结果符合度最高的是基于SOS反应的umu-lacZ体系。当检测菌株受到诱变剂作用后会启动SOS反应,umuDC基因表达上调,通过检测β-半乳糖苷酶的酶活就可以检测样品诱变性的强弱。目前,该方法被广泛用于饮用水和污水的致突变检测,并已制定了国际标准。该方法需要检测酶活,尽管可以高通量进行,但是为了简化操作并排除中药药液的颜色对酶活检测的影响,尝试将报告基因lacZ替换为EGFP,构建了umu-EGFP体系,经过验证,该体系检测灵敏度太低,不适合中药体外致突变检测;
　　3.为了提高检测的灵敏度,将umuDC基因启动子替换为recA基因的启动子,构建了rec-EGFP体系,经过阳性诱变剂的验证该体系可用于体外致突变检测。通过与umu-lacZ体系以及之前的染色体畸变结果比较发现,rec-EGFP体系在中药的检测中表现出了较高的阳性率,但该体系在阳性诱变剂的检测中表现正常,其中的原因有待深入研究。
　　4.考虑到umu-lacZ体系有可供参考的国际标准,对该体系的96孔板法进行了改进,在检测酶活之前增加离心洗涤的操作,可以排除中药颜色带来的影响,改进后该方法可以高通量检测中药的体外致突变性,检测结果与染色体畸变实验结果较一致。
　　5.应用umu-lacZ体系对常用的几十种中药饮片进行了检测,为建立一个常用中药饮片体外致突变性的数据库提供了部分数据,希望为临床的合理和安全用药提供指导。
　　本课题的研究结果为现有国家标准的修正提供了参考,同时为建立新的国家标准做好了铺垫。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

第一章 绪论

1.1 中药安全性评价的迫切性

1.2 体外致突变检测方法简介

1.2.1 经典Ames试验

1.2.2 SOS反应的机理

1.2.3 基于SOS反应的检测体系中常用的报告基因

1.2.4 几种常用的基于SOS反应的检测体系

1.3 本文的主要研究内容

第二章 基于SOS反应的体外致突变检测体系

第一节 umu-lacZ体系

2.1 材料与方法

2.2 结果与讨论

第二节 umu-EGFP体系

2.3 材料与方法

2.4 结果与讨论

第三节 rec-EGFP体系

2.5 材料与方法

2.6 结果与讨论

2.7 小结

第三章 几种方法在中药体外致突变检测中的应用

3.1 材料与方法

3.1.1 菌株

3.1.2 试剂和仪器

3.1.3 umu-lacZ体系

3.1.4 掩盖法

3.2 结果与讨论

3.2.1 S9溶液催化活性的验证

3.2.2 掩盖法对八种中药体外致突变的检测结果

3.2.3 掩盖法对阳性诱变剂的检测结果

3.2.4 rec-EGFP体系对中药体外致突变的检测结果

3.2.5 umu-lacZ体系对24种中药的检测结果

3.3 小结

全文总结

参考文献

致谢

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