拟威克酵母利用中等碳链长度烷烃合成槐糖脂的研究

摘要

生物表面活性剂主要是微生物在一定条件下培养时，在其代谢过程中分泌出的具有一定表面活性的代谢产物。生物表面活性剂与化学合成表面活性剂性能相似，但相比之下，生物表面活性剂可生物降解，具有较好的环境相容性，无毒或低毒，结构多样，可适用于多种环境。因此对生物表面活性剂已进行广泛的研究，并极有可能替代化学合成的表面活性剂。
　　 槐糖脂是一种重要的糖脂类生物表面活性剂，目前己获得广泛的研究。槐糖脂分子由亲水性部分和疏水性部分组成，疏水性部分是饱和或不饱和的十六或十八个碳原子的ω-（或ω-1）羟基脂肪酸，亲水性部分是一分子槐糖（葡萄糖-β-1，2-葡萄糖苷），分为内酯型和酸型两大类。本实验室从环境中分离出的非致病性拟威克酵母菌株(Wickerhamiella domericqiae Y2A)可产生320 g/L的槐糖脂，具有极大的商业化应用潜力。因此对槐糖脂深入研究有助于我们得到具有优良表面特性的新型槐糖脂，为扩展槐糖脂在日化、食品及医药等众多领域的应用奠定基础。
　　 本论文主要的研究内容及结果如下:
　　 1.对中等碳链长度槐糖脂的分离、纯化及鉴定。
　　 在发酵培养基中添加中等碳链长度的烷烃（正辛烷、正癸烷、正十二烷和正十四烷）为亲脂性底物，同时以只添加葡萄糖的发酵培养基为对照，采用HPLC-MS的方法分析拟威克酵母所产槐糖脂的种类，并采用GC-MS的方法分析槐糖脂粗品中脂肪酸的碳链长度、不饱和度、末端羟基化的程度。以正辛烷为亲脂性底物时，采用两种分析方法均未检测到中等碳链长度槐糖脂及脂肪酸的存在。以正癸烷为亲脂性底物时，HPLC-MS分析可检测到一定量的碳链长度为14的酸型槐糖脂的存在。当发酵培养基中加入正十二烷时，两种方法均可检测到较大含量的碳链长度为12和14的酸型槐糖脂。以正十四烷为亲脂性底物时，可检测到对应长度的饱和及单不饱和的酸型槐糖脂。四种培养条件下均检测到正常碳链长度的酸型和内酯型槐糖脂，未检测到中等碳链长度的内酯型槐糖脂的存在。这些结果表明，通过向培养基中添加碳链长度12以上的烷烃，可得到大量碳链长度为12和14的酸型槐糖脂。
　　 2.实时荧光定量PCR检测与脂肪酸碳链延长和代谢相关基因的转录分析。
　　 分别选取四个与脂肪酸代谢和β氧化相关的基因和一个线粒体内与脂肪酸延长相关基因，检测5个基因在以四种中等碳链长度的烷烃为亲脂性底物合成槐糖脂时的表达差异。与加入正辛烷相比，拟威克酵母在十四烷烃培养条件下，与脂肪酸代谢和β氧化相关的四个基因的表达量较大;同理，与正癸烷相比，在正十二烷烃培养条件下，与脂肪酸代谢相关的四个基因的表达量较大。这表明拟威克酵母对较长碳链的烷烃的降解幅度较大。
　　 3.编码脂肪酸合酶α亚基基因的敲除及该基因敲除株（△F）所产槐糖脂组分分析。
　　 依据基因重组的原理和double-joint PCR的片段融合方法，构建了长度为6157 bp的携带潮霉素B抗性基因的编码乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因（ura3）的敲除盒。采用电转化的方法，成功得到尿嘧啶营养缺陷型的拟威克酵母菌株。以此菌株为出发菌株，构建长度为4395 bp的携带ura3基因的敲除盒，将该同源同组片段通过电转化的方法转入尿嘧啶营养缺陷型的拟威克酵母菌株。以十二烷烃为发酵的亲脂性底物，采用GC-MS和HPLC-MS的方法检测脂肪酸合酶α亚基基因的敲除株与野生拟威克酵母菌株发酵产物的差异。以正十二烷烃为亲脂性底物，脂肪酸合酶α亚基基因被敲除后，拟威克酵母所产槐糖脂的主要组分是亲脂性基团为油酸的双乙酰化的酸型槐糖脂。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 生物表面活性剂

1．1．1 生物表面活性剂

1．1．2 生物表面活性剂特性

1．1．3 生物表面活性剂的应用

1．2 微生物表面活性剂的种类及其生物来源

1．2．1 脂肽和脂蛋白

1．2．2 磷脂、脂肪酸、中性脂

1．2．3 聚合表面活性剂

1．2．4 微粒表面活性剂

1．2．5 糖脂

1．3 槐糖脂简介

1．3．1 槐糖脂的结构及其特性

1．3．2 产槐糖脂的菌株

1．3．3 槐糖脂的合成途径

1．3．4 培养基成分对槐糖脂合成的影响

1．3．5 槐糖脂的应用

1．3．6 产槐糖脂菌株的遗传操作体系

1．3．7 槐糖脂研究进展及存在问题

1．4 本文研究内容及目的意义

第二章 拟威克酵母利用中等链长烷烃所产槐糖脂的分析与鉴定

引言

2．1 材料与方法

2．1．1 菌株、培养基及培养条件

2．1．2 主要试剂及仪器

2．1．3 槐糖脂测定方法

2．1．4 槐糖脂甲酯化

2．1．5 HPLC-MS分析的时间程序

2．1．6 GC-MS分析的时间程序

2．2 结果与分析

2．2．1 以正辛烷为底物发酵产槐糖脂的分析

2．2．2 以正癸烷为底物发酵产槐糖脂的分析

2．2．3 以正十二烷为底物发酵产槐糖脂的分析

2．2．4 以正十四烷为底物发酵的槐糖脂的分析

2．2．5 以葡萄糖为底物

2．3 小结

第三章 与脂肪酸代谢和延长相关基因的转录差异分析

引言

3．1 材料与方法

3．1．1 菌株、引物及转录差异分析的基因

3．1．2 培养基和培养方法

3．1．3 常用缓冲液、试剂和设备

3．1．4 标准曲线的制作

3．1．5 拟威克酵母总RNA的提取及cDNA的合成

3．1．6 脂肪酸代谢相关基因的实时荧光定量PCR分析

3．2 结果与分析

3．2．1 总RNA提取质量

3．2．2 反转录后PCR验证

3．2．3 荧光定量PCR标准曲线的制作

3．2．4 荧光定量PCR定量结果的有效性分析

3．2．5 在正辛烷和正十四烷培养条件下各基因转录差异分析

3．2．6 在正癸烷和正十二烷培养条件下各基因转录差异分析

3．3 小结

第四章 脂肪酸合酶α亚基基因的敲除及敲除株合成槐糖脂的分析

前言

4．1 材料与方法

4．1．1 菌株和质粒

4．1．2 培养基和培养方法

4．1．3 试剂、工具酶与仪器

4．1．4 酵母基因组DNA小量提取

4．1．5 总RNA的提取及cDNA的合成

4．1．6 简并引物设计与脂肪酸合酶α亚基基因片段克隆

4．1．7 TAIL-PCR扩增基因5’端和3’端

4．1．8 克隆、测序与序列分析

4．1．9 尿嘧啶营养缺陷型菌株的获得

4．1．10 拟威克酵母的转化方法

4．1．11 脂肪酸合酶α亚基基因营养缺陷型菌株的获得

4．1．12 脂肪酸合酶α亚基基因敲除株与野生菌株发酵产槐糖脂的分析

4．2 结果与分析

4．2．1 脂肪酸合酶α亚基基因的扩增

4．2．2 ura3基因的敲除

4．2．3 脂肪酸合酶α亚基基因的敲除

4．2．4 ΔF敲除株所产槐糖脂的分析

4．3 小结

论文创新性结果和展望

参考文献

攻读学位期间发表和撰写的学位论文

致谢

学位论文评阅及答辩情况表