牵张力调节血管平滑肌细胞ACE2表达的分子机制及其介导的生物学效应研究

摘要

第一部分：牵张力介导血管紧张素转换酶2的表达及其对平滑肌细胞功能影响的研究
　　 血管重构被公认为高血压、冠心病等心血管疾病的重要病理特点，它是指血管管腔面积及形态、管壁结构和成分、血管功能的慢性改变。机械性损伤、炎症、低氧、血流动力学异常等多种因素均参与血管重构的形成。由于血管一直暴露于血流动力学的作用中，异常的血液流体力学在血管重构中的作用及其分子机制，受到国内外学者越来越多的关注。深入研究血管重构的分子机制，确定在这一过程中发挥重要作用的分子和潜在药物靶点，对于预防和减少心血管疾病的死亡率具有重大意义。
　　 人体血管长期暴露于搏动性血流的冲击下，主要承受着两种形式的生物力，一种是平行于血管长轴的剪切力(shearstress)，主要作用于血管内皮细胞;另一种是垂直于血管长轴的牵张力(stretchstress)，可影响血管壁各种细胞成分，但位于管壁中层的平滑肌细胞是其主要靶细胞。两种生物力对于血管功能的调节均具有重要作用。研究认为，平滑肌细胞受到牵张力的刺激时，其胞膜表面的各种受体分子、离子通道等将膜外机械性的刺激信号转化为胞内的生物信号，激活一系列胞内信号转导通路及转录因子，通过影响相关基因的表达调节细胞增殖、凋亡、迁移、分化等生物学功能。
　　 肾素-血管紧张素（RAS）系统是影响血管形态与功能的重要因素。由血管紧张素转化酶(ACE)催化产生的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是RAS系统的主要效应分子，它在心血管重构过程中发挥重要作用。AngⅡ不仅具有直接刺激平滑肌细胞增殖、迁移等功能改变的作用，还介导牵张力对平滑肌细胞生物学功能的影响与相应的细胞内信号转导通路的激活。在体外培养的乳鼠心肌细胞和成纤维细胞中，牵张力刺激能够诱导心肌细胞分泌AngⅡ，而且不依赖于AngⅡ而上调肾素、ACE、AT1R、AT2R等基因的表达，而在心肌成纤维细胞中则没有上述作用，这说明牵张力本身具有独立调控局部RAS系统基因表达的作用，而且具有一定的细胞特异性。新近的研究也表明是组织局部RAS，而不是循环RAS和炎症因子，对高血压性心血管重构起着重要作用。因此，进一步探索血管局部RAS系统在牵张力介导的血管生物学功能中的作用及其机制具有重要的临床意义。
　　 血管紧张素转化酶2(ACE2)是一个新发现的RAS系统成员，对其生物学功能的研究成为近年来的热点。研究发现，ACE2具有降解AngⅡ生成血管紧张素1-7(Ang-1-7)的作用，后者通过其特异的Mas受体，拮抗ACE-AngⅡ信号通路的不良生物学作用，其被认为是RAS系统的负性调节因子，也是参与心血管重构的重要分子。此外，如RAS系统其它组分一样，实验证实生物力学因素也可以调节ACE2的表达。ACE2在血管内皮细胞及动脉平滑肌细胞中均有表达，其组织特异性表达及其对关键血管活性肽AngⅡ独特的分解能力，提示它在血管局部RAS中扮演重要角色。与RAS系统的ACE/AngⅡ/AT1R轴相比，ACE2与生物力学的关系目前还知之甚少。由于ACE2在心血管重构中的保护作用及其对心血管细胞增殖、迁移、胶原代谢等生物学功能的影响，我们推测其在牵张力调节平滑肌细胞功能中发挥重要作用。
　　 基于近年来的研究对ACE2在血管平滑肌细胞功能中作用的阐述，以及牵张力调节平滑肌细胞功能的重要性，我们特提出以下科学假说:(1)牵张力调节血管平滑肌细胞ACE2的表达，不同强度的牵张力对ACE2表达的影响不同;(2)牵张力影响包括ACE2在内的RAS系统各主要成分的表达，ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴与ACE-AngⅡ-AT1R轴在牵张力作用下，相互对抗、相互影响，参与不同大小牵张力对平滑肌细胞生物学作用的影响。
　　 研究目的：
　　 1.在体外细胞研究中，明确牵张力对血管平滑肌细胞ACE2表达及活性的影响。
　　 2.明确ACE2在牵张力调节平滑肌细胞生物学功能中的作用。
　　 3.通过体内实验验证力学对血管平滑肌细胞ACE2表达的影响。
　　 研究方法：
　　 1.细胞培养及传代:
　　 培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)，待细胞生长融合后，PBS冲洗细胞两遍，以去除血清，加0.25％胰蛋白酶在细胞培养箱中消化2分钟，在倒置显微镜下观察到细胞变圆时，吸出胰蛋白酶，加入新的完全培养基吹打混匀，转入新的细胞培养瓶中继续培养。
　　 2.平滑肌细胞牵张力干预分组:
　　 接种平滑肌细胞至铺有Ⅰ型胶原的Flexcell六孔板中，待细胞生长至90％融合时，采用无血清培养基诱导细胞静止24h，然后更换新的完全培养基，利用Flexcell-5000Tension细胞拉力仪给予细胞牵张力刺激，具体分组如下:
　　 (1)静止对照组:不给予牵张力刺激，其它条件与牵张力干预组相同;
　　 (2)10％牵张力组:给予最大峰值为10％的周期性牵张力分别刺激细胞1、3、6、12、24小时，牵张频率为1Hz;
　　 (3)15％牵张力组:给予最大峰值为15％的周期性牵张力分别刺激细胞1、3、6、12、24小时，牵张频率为1Hz;
　　 在各个时间点，不同强度牵张力干预平滑肌细胞结束后，连同静止对照组一起收集细胞分别提取蛋白与总RNA，-80℃保存待测血管紧张素Ⅱ(Ang-Ⅱ)及血管紧张素1-7含量（Ang-1-7）。
　　 3.细胞存活率检测:
　　 平滑肌细胞经不同强度牵张力刺激12小时后，胰酶消化的方法收集细胞，PBS重悬，台酚蓝染色液染色5分钟，用血细胞计数板计数，计算细胞存活率。细胞存活率=（细胞总数-蓝色细胞数）/细胞总数×100％。
　　 4.实时荧光定量PCR检测ACE2、ACE、MASmRNA表达:
　　 根据试剂盒说明，用Trizol提取入主动脉平滑肌细胞总RNA，用Takara试剂盒进行逆转录，在Bio-Rad公司生产的IQ5上进行实时定量PCR。每个样本重复测量三次。ACE2扩增引物序列:上游5’-CATTGGAGCAAGTGTTGGATCTT-3’，下游5'-GAGCTAATGCATGCCATTCTCA-3’;ACE扩增引物序列:上游5'-GCGGCTCTTCCAGGAGCTGC-3’，下游5’-CTGCGCCCACATGTTCCCCA-3’;MAS扩增引物序列:上游5’-GGCCTCCTCATGGATGGGTCAA-3’，下游5’-GTGCATTCCCGACTGAGGCGT-3’;β-actin扩增引物序列，上游5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’，下游5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。反应结束得到Ct值（循环阈值），用相对定量的方法计算2-ΔΔCt，并分析数据。ACE2、ACE、MASmRNA表达以管家基因β-actin进行标准化。
　　 5.WesternBlot:
　　 收集细胞后，提取胞浆胞膜总蛋白，加入蛋白上样缓冲液，在99℃煮沸10分钟，SDS-PAGE电泳，转膜，脱脂奶封闭，用1×TBST洗膜3次。将PVDF膜放入合适比例的一抗中，4℃孵育过夜，洗膜。合适比例的二抗孵育1小时，洗膜，最后采用Millipore显色液进行发光，柯达胶片显影完成后观察结果。
　　 6.ACE2活性测定:
　　 各种条件干预后收集细胞，提取胞浆蛋白。采用7-Mca-YVADAPK(Dnp)作为反应底物，ACE及ACE2都能分解这一底物的2，4-二硝基苯基部分，而2，4-二硝基苯基能够淬灭7-甲氧基香豆素部分的荧光，它的分解造成荧光增强。20μg的总蛋白提取物与1.0μmol/L7-Mca-YVADAPK(Dnp)混合后室温下孵育，终容积为100μL。采用酶标仪读取激发光320nm及散射光400nm的荧光强度，动态读取荧光值4小时。ACE2活性定义为:ACE2活性=无抑制剂时的荧光强度-ACE2抑制剂DX-600存在时的荧光强度。每个样本测量三次，最后数值采用RFU/mg/hour。
　　 7.Ang-(1-7)及AngⅡ产物测定:
　　 不同水平牵张力干预平滑肌细胞后，收集胞浆蛋白，ELISA法检测胞浆蛋白中Ang-(1-7)及AngⅡ的含量。
　　 8.细胞免疫荧光法检测ACE2的表达:
　　 HASMCs接种于Flex-5000Tension6孔板中，至细胞生长至90％融合时，更换无血清培养基诱导细胞静止24小时后，分为两组，即静态组、10％牵张力干预12小时组。干预结束后弃培养液，PBS洗3次，加入免疫染色固定液固定30min，PBS冲洗，剪下种有细胞的膜，采用免疫荧光染色，滴加相应抗体血清，再滴加1∶200荧光素标记的二抗，设阴性及空白对照。荧光显微镜下观察、拍片，直观明确牵张力对平滑肌细胞中ACE2的表达是否有作用。
　　 9.细胞转染:
　　 利用阳离子脂质体，转染不同浓度的ACE2小干扰RNA(ACE2-siRNA)及阴性对照小干扰RNA(negativecontrolsiRNA)，ACE2siRNA序列为:Forward5'-CCAUCUACAGUACUGGAAAdTdT-3';Reverse5'-UUUCCAGUACUGUAGAUGGdTdT-3'。negativecontrolsiRNA序列为:Forward5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdtdt-3';Reverse5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdtdt-3，。转染48小时后收集细胞，提取胞浆总蛋白，Westernblot测定ACE2蛋白表达以评价干扰效果，选取合适的siRNA浓度;按照合适的siRNA浓度进行下一步实验。
　　 10.ACE2在牵张力调节平滑肌细胞生物学功能中作用的研究
　　 (1)培养HASMCs，给予生理范围的牵张力(10％elongation，1Hz)刺激12h。
　　 (2)采用Brdu掺入法、细胞划痕技术，明确牵张力对HASMCs增殖、迁移的影响。
　　 (3)预先转染ACE2小干扰RNA(siRNA)及其阴性对照后再给予牵张力干预，观察对上述平滑肌细胞生物学功能的影响，明确ACE2在牵张力调节HASMCs生物学功能中的作用。
　　 11.体内实验观察压力负荷改变对血管平滑肌细胞ACE2表达的影响
　　 (1)动物模型构建
　　 20只12周龄雄性C57BL/6小鼠，分为两组，手术组(n=10)，假手术组(n=10)。手术组自胸骨上窝结扎主动脉弓部致其缩窄，假手术组术式与手术组相同，但不做主动脉弓缩窄。并分别于术后24小时后处死动物留取标本。
　　 (2)压力负荷改变与主动脉平滑肌细胞中ACE2表达的关系
　　 应用实时定量PCR、Westernblot技术分别测定主动脉弓结扎上、下游血管段ACE2的mRNA和蛋白表达水平;免疫组化双染测定ACE2在血管平滑肌细胞中的表达。
　　 12.统计学分析
　　 所有数据采用均数±标准误(mean±SEM)表示，两两比较采用t检验，多组之间比较采用单因素方差分析，使用SPSS16.0统计软件分析，P＜0.05认为有统计学意义。
　　 结果：
　　 1.不同作用时间下，不同水平的牵张力对主动脉平滑肌细胞ACE2、ACE、MASmRNA表达的影响
　　 研究结果显示，ACE2与ACE、MAS均为牵张力敏感的RAS基因。与静态对照组比较，10％牵张力作用后1小时ACE2、MAS、ACEmRNA水平与静态对照组相比未见明显改变(P＞0.05），作用3h后ACE2mRNA水平比静态对照组明显增高，于6h达峰(3.1fold，P＜0.01)，而且增高趋势保持到24h，MASmRNA水平自3h开始上升，6h达到峰值(2.4fold，P＜0.01)，24小时仍比静态对照组明显增高，而ACEmRNA水平在1h、3h时轻度增高但无显著性意义，在10％牵张力作用12h、24h时ACEmRNA水平较静态组明显降低(0.41fold，P＜0.05);与静态对照组比较，15％牵张力作用3h后，ACE2、MASmRNA水平比静态对照组表达增高(分别为1.8fold，1.65fold，P＜0.01，P＜0.05)，15％牵张力作用12、24小时后，其ACE2、MASmRNA水平比静态对照组明显降低(0.37fold，0.44fold，P＜0.05)，而ACEmRNA水平在15％牵张力作用6h显著增高，12h达峰(2.35fold，P＜0.01)，于24h仍较静态组明显增加(2.19fold，P＜0.01);将PCR产物行琼脂糖凝胶电泳结果显示:ACE2于108bp、ACE于142bp、MAS于94bp处显示清晰的条带。为了观察RAS系统中两个主要的酶对相同牵张力的不同反应，我们比较了相同牵张力情况下ACE2及ACE的变化情况，结果表明:在10％的牵张力作用下1小时，ACE2比ACE明显上调(P＜0.05)，而继续牵张3h至24h，与ACE的mRNA水平相比，ACE2始终明显高表达(P＜0.01);而15％的牵张力作用1小时、3小时，ACE2与ACE的mRNA表达没有显著性差异，继续牵张至6小时，ACE的mRNA表达较ACE2明显上调(P＜0.05)，至12、24小时，ACE的mRNA表达保持显著上调(P＜0.01)。
　　 2.WesternBlot结果
　　 Westernblot结果显示，10％牵张力干预细胞1、3小时，ACE2蛋白表达未见有明显改变(P＞0.05)，干预HASMCs6小时后，ACE2蛋白表达较静态对照组明显升高（P＜0.01），10％牵张力干预24小时之后，ACE2蛋白表达水平仍然增高(P＜0.01);而15％牵张力刺激细胞3小时后，引起ACE2蛋白表达水平短暂升高(P＜0.01），而在12、24小时，ACE2表达呈明显下调趋势(P＜0.01)。
　　 3.ACE2活性变化
　　 10％牵张力分别干预HASMCs1、3、6小时后，ACE2活性没有显著改变;12小时后，ACE2活性比静态对照组明显增加并达到峰值(P＜0.01)，而且这种增高趋势持续到24h;15％牵张力分别干预HASMCs1、3、6小时，对ACE2的活性均没有显著影响，干预12、24小时后，ACE2活性显著降低(P＜0.01)。
　　 4.牵张力对Ang-(1-7)及AngⅡ产生量的影响
　　 10％牵张力作用1h、3h、6h后，AngⅡ、Ang-(1-7)水平与静态对照组相比未见明显改变(P＞0.05);10％牵张力作用12h、24h后，与静态对照组相比，AngⅡ水平明显降低(P＜0.01)，而Ang-(1-7)水平明显升高(P＜0.05，P＜0.01)。15％牵张力作用1h、3h后，AngⅡ、Ang-(1-7)水平比静态对照组无明显变化，15％牵张力作用6h后，其AngⅡ水平比静态对照组显著增加(P＜0.05)，而Ang-(1-7)水平较静态组无显著变化(P＞0.05)。15％牵张力作用12h、24h后，AngⅡ水平比静态对照组显著升高(P＜0.05，P＜0.01)，而Ang-(1-7)水平明显降低(P＜0.05，P＜0.01)。
　　 5.ACE2免疫荧光法检测结果
　　 给予HASMCs10％周期性牵张力干预12小时，细胞免疫荧光进一步显示:与静态培养相比，生理牵张力显著上调ACE2蛋白表达水平。
　　 6.ACE2在牵张力调节平滑肌细胞生物学功能中的作用
　　 (1)采用Brdu掺入法结果提示10％牵张力能够抑制HASMCs的增殖。
　　 (2)细胞划痕实验证明10％牵张力能够抑制HASMCs的迁移。
　　 (3)转染ACE2siRNA48小时后ACE2表达水平显著下调，与单纯牵张力组比较，下调ACE2的表达能够部分抵消10％牵张力抑制平滑肌细胞增殖、迁移的作用。
　　 7.组织免疫荧光检测结果
　　 实验动物共20只，除1只死于手术前麻醉外，其余全部成活并顺利完成实验。
　　 组织免疫荧光结果显示:与假手术组相比，ACE2在结扎近心端的主动脉平滑肌细胞中表达明显减低;而在结扎远心端的主动脉平滑肌细胞中表达没有明显改变;Westernblot及实时定量PCR结果亦显示:主动脉弓结扎近心端ACE2蛋白及mRNA表达水平下调，而主动脉弓结扎远心端血管段ACE2表达没有变化。
　　 结论：
　　 1.生理性牵张力能够持续上调平滑肌细胞中ACE2的表达，而病理性牵张力早期虽上调ACE2表达，但随干预时间延长其表达呈现下调趋势。
　　 2.ACE2参与生理牵张力对平滑肌细胞增殖、迁移的抑制作用;
　　 3.在主动脉弓结扎的小鼠中，与假手术组相比，异常的牵张力增加可以降低血管平滑肌细胞ACE2的表达。
　　 第二部分：牵张力调控血管平滑肌细胞ACE2的分子机制研究
　　 由于血管一直暴露于血流动力学的作用下，异常的血液流体力学可作用于血管壁细胞导致动脉血管病变的发生、发展。我国高血压患者已高达2亿，高血压病往往伴有周期性机械牵张力的增加，从而引起血管壁平滑肌细胞的形态和功能改变，进一步造成血管重构，导致高血压终末器官损害如心、脑血管疾病及高血压肾病的发生、发展;位于血管壁中层的平滑肌细胞的形态和功能异常在动脉血管疾病的发生、发展过程中发挥重要作用。肾素-血管紧张素(RAS)系统与心血管疾病密切相关，近年来，RAS系统新成员血管紧张素转化酶2(ACE2)对血管的保护作用受到了重视，ACE2在高血压大鼠血管壁中、糖尿病心肌病和肾病以及心肌梗死动物模型中可以改善心脏及血管重构。我们实验室最近的研究证明在动脉粥样硬化模型中ACE2过表达可延缓斑块的发生发展，具有减少斑块易损指数，稳定斑块的作用。机械牵张力可影响平滑肌细胞AngⅡ的分泌，但是对于ACE2的作用尚不明了。我们的前期研究发现与静态对照组比较，生理牵张力(10％elongation，1Hz)显著上调血管平滑肌细胞ACE2的表达及活性，而过度增强的病理牵张力(15％elongation，1Hz)却下调血管平滑肌细胞ACE2的表达与活性，此外，我们的前期研究还发现ACE2参与牵张力对平滑肌细胞增殖、迁移功能的调节作用。这些研究提示:机械牵张力可能通过ACE2影响平滑肌细胞的功能和血管壁的重构，但是牵张力调控ACE2的确切机制尚需进一步的深入研究。近年来关于牵张力调节平滑肌细胞功能的分子机制研究取得了一定进展。尽管迄今尚未发现细胞表面存在特异的生物力学信号感受器，但位于胞膜表面的整合素、酪氨酸受体激酶、离子通道、小凹蛋白等结构均可以将胞外的力学刺激传导到胞内，激活PKC、MAPK、PI3K/Akt等多种信号转导通路以及活化AP-1、NF-κB、Egr-1、Sp-1等多种转录因子，最终通过改变细胞增殖、凋亡、表型分化等相关基因的表达而影响细胞功能。
　　 近年来，有关学者利用病毒载体或人工重组合成ACE2，在动物水平充分证明了ACE2的心血管保护作用，在体外水平上验证了其对各种细胞生物学功能的影响。然而，各种病理生理刺激调控ACE2表达的分子机制目前还知之甚少。尽管有研究发现在体外培养的平滑肌细胞中AngⅡ可以通过激活ERK1/2信号通路抑制ACE2表达，但另一项研究却发现在肝星状细胞中，AngⅡ上调ACE2的表达;此外，研究表明过表达ACE2同样可以抑制ACE、AT1R的表达，及AngⅡ的分泌。以上充分说明了ACE2表达调控与RAS系统各组分之间关系的复杂性。既往有研究表明，高糖可以下调PKC-βⅡ的表达，后者可以下调SMCs中ACE2的表达及Ang-(1-7)的生成;牵张力可以激活MAPK、Akt、PKC信号通路，并活化AP-1、NF-κB、Sp-1等转录因子，而ACE2启动子序列中含有多个AP-1、Sp-1结合位点。但是牵张力如何影响ACE2表达的机制目前尚未见文献报道。目前在心血管领域，关于ACE2的研究大多数集中在对其下游功能的研究上，而对其自身表达调控知之甚少，牵张力通过什么信号通路调节血管平滑肌细胞上ACE2的表达？AP-1、NF-κB是否参与牵张力调节ACE2表达？这些问题都有待实验进一步证实。
　　 本研究拟在前期研究的基础上，深入研究生理性周期牵张力(10％elongation，1Hz)调节血管平滑肌细胞ACE2表达的分子机制，该研究将对动脉血管疾病的发生机制提供新的思路，对进一步理解RAS系统在维持血管功能与血管重塑中的作用与机制，寻找干预血管重构相关疾病的新靶点，具有重要的现实意义。
　　 研究目的：
　　 1.明确生理牵张力对ACE2启动子活性及mRNA稳定性的影响;
　　 2.确定生理牵张力调节人平滑肌细胞ACE2表达的关键转录因子;
　　 3.明确生理牵张力调节人平滑肌细胞ACE2表达的主要信号通路。
　　 研究方法：
　　 1.人主动脉平滑肌细胞培养及牵张力干预
　　 前期实验购得人主动脉平滑肌细胞株(HASMCScienCell)，采用ScienCell平滑肌细胞专用培养基(SMCGS、2％FBS、1％penicillin-streptomycin)培养细胞，4-7代细胞用于实验。接种平滑肌细胞(HASMCs)至铺有Ⅰ型胶原的Flexcell六孔板中（105个细胞/孔），待细胞生长达90％融合时，无血清培养基诱导培养24小时，更换新的完全培养基，使用Flexcell-5000Tension细胞拉力仪给予细胞牵张力(10％elongation，1Hz)刺激。
　　 2.细胞牵张力干预分组
　　 2.1、牵张力对ACE2mRNA稳定性的影响
　　 (1)静态对照组:静态培养平滑肌细胞，不给予任何通路抑制剂干预。
　　 (2)牵张力干预组:给予HASMCs牵张力(10％elongation，1Hz)刺激12小时。
　　 牵张力刺激12小时后，与静止对照组一起，添加放线菌素D(5ug/ml)至细胞培养上清中，以抑制新的转录，分别用放线菌素D干预0、6、12小时，利用TRIzol提取细胞总RNA并逆转录为cDNA，利用实时荧光定量PCR检测mRNA的表达，结果以不同时间点的mRNA水平与加入放线菌素D0小时的mRNA的比值来表示。观察与静态对照组相比较，生理牵张力是否增加平滑肌细胞ACE2mRNA的稳定性。
　　 2.2、牵张力对ACE2启动子活性的影响
　　 设计ACE2启动子PCR扩增引物，PCR扩增、电泳后切胶，并行PCR产物回收，连接T载体和细胞转化，构建ACE2启动子载体(pGL3-ACE2-promoter)，利用Invitrogenlip2000将启动子载体与PRL-TK载体共转染平滑肌细胞24小时后，给予牵张力(10％elongation，1Hz)刺激3小时或静止培养3小时，利用Promega双荧光素酶报告基因检测系统检测牵张力(10％elongation，1Hz)对ACE2启动子活性的影响。
　　 2.3、确定介导生理牵张力(10％elongation，1Hz)调节平滑肌细胞ACE2表达的关键转录因子
　　 (1)静态对照组:静态培养平滑肌细胞，不给予任何通路抑制剂干预。
　　 (2)牵张力对照组:分别给予HASMCs牵张力干预15min、30min、1h、2h。
　　 (3)SN50组:先给予HASMCsSN50(18μM)预处理1小时，再给予牵张力刺激6小时。
　　 (4)Curcumin组:先给予HASMCsCurcumin(10uM)预处理1小时，再给予牵张力刺激6小时。
　　 (5)WP631组:先给予HASMCsWP631(100nM)预处理1小时，再给予牵张力刺激6小时。
　　 Westernblot检测p65、p-p65、c-fos、p-c-fos、c-jun、p-c-jun、Sp-1、p-Sp-1、ACE2蛋白表达;实时荧光定量PCR检测ACE2mRNA变化;EMSA检测NF-κ3、AP-1的DNA结合能力;
　　 2.4、MAPK信号通路在牵张力(10％elongation，1Hz)调节平滑肌细胞ACE2表达中的作用
　　 (1)静态对照组:静态培养平滑肌细胞，不给予任何通路抑制剂干预。
　　 (2)牵张力对照组:分别给予HASMCs牵张力刺激15min、30min、1h、2h。
　　 (3)PD98059组:先给予HASMCsERK1/2抑制剂PD98059(30uM)预处理1小时，再给予牵张力刺激6h。
　　 (4)SP600125组:先给予HASMCsJNK1/2抑制剂SP600125（20μM）预处理1小时，再给予牵张力刺激6h。
　　 (5)SB203580组:先给予HASMCsp38抑制剂SB203580(10μM)预处理1小时，再给予牵张力刺激6h。
　　 Westernblot检测ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK1/2、p-JNK1/2、ACE2的蛋白表达;实时荧光定量PCR检测ACE2mRNA变化;并检测下游转录因子的活性。
　　 2.5、PKC-Ⅱ信号通路在牵张力(10％elongation，1Hz)调节平滑肌细胞ACE2表达中的作用
　　 (1)静态对照组:静态培养平滑肌细胞，不给予任何通路抑制剂干预。
　　 (2)牵张力对照组:分别给予HASMCs牵张力刺激15min、30min、1h、2h。
　　 (3)CG53353组:先给予HASMCsPKC-βⅡ抑制剂CG53353（100nM）预处理1小时，再给予牵张力刺激6h。
　　 观察PKC-βⅡ的磷酸化水平;ACE2mRNA及蛋白表达水平;下游转录因子的活性。
　　 2.6、Akt信号通路在牵张力(10％elongation，1Hz)调节平滑肌细胞ACE2表达中的作用
　　 (1)静态对照组:静态培养平滑肌细胞，不给予任何通路抑制剂干预。
　　 (2)牵张力对照组:分别给予HASMCs牵张力刺激15min、30min、1h、2h。
　　 (3)LY294002组:先给予HASMCsAkt抑制剂LY294002(50μM)预处理1小时，再给予牵张力刺激6h。
　　 观察Akt、p-Akt的表达;ACE2mRNA、蛋白表达水平。
　　 3.实验方法
　　 应用实时定量PCR法检测ACE2mRNA的表达量;用Westernblot技术检测信号蛋白表达和磷酸化水平;EMSA检测AP-1、NF-κB与DNA的结合活性。
　　 4.统计学分析
　　 实验数据以均数±标准误表示。使用SPSS16.0软件中的单因素方差分析对结果进行分析，两两比较采用t检验。P＜0.05认为差异具有统计学意义。
　　 结果：
　　 1.牵张力对ACE2mRNA稳定性无明显影响
　　 给予HASMCs10％周期性牵张力干预12小时后，与放线菌素D(5μg/ml)孵育以阻断新的转录合成，静态培养的细胞给予同样剂量的放线菌素D处理作为对照，分别在放线菌素D干预0小时、6小时、12小时提取RNA，利用实时荧光定量PCR检测mRNA的表达，结果以不同时间点的mRNA水平与加入放线菌素D0小时的mRNA的比值来表示。结果表明:与静态对照组相比较，牵张力干预组平滑肌细胞mRNA的降解速度没有明显的变化(P＞0.05)。
　　 2.生理牵张力(10％elongation，1Hz)明显增强ACE2启动子活性
　　 成功构建人ACE2启动子载体(pGL3-ACE2-promoter)，ACE2启动子长度1908bp;利用脂质体2000分别转染pGL3-ACE2-promoter与pGL3-basicvector，然后给予10％周期性牵张力刺激HASMCs3小时，收集细胞，利用Promega双萤光素酶报告基因检测试剂盒测定牵张力干预组及静态对照组细胞ACE2启动子的活性。结果显示，10％牵张力显著增强ACE2启动子的活性(2.7fold，P＜0.05)。
　　 3.AP-1调节牵张力(10％elongation，1Hz)介导的HASMCsACE2mRNA、蛋白表达变化
　　 分别给予平滑肌细胞10％周期性牵张力刺激15分钟、30分钟、1小时、2小时，收集细胞提取胞浆蛋白，Westernblot检测AP-1的两个主要组分c-jun、c-fos，以及磷酸化形式的c-jun，c-fos的表达情况，结果显示:10％牵张力上调c-jun以及磷酸化c-jun的表达，但对c-fos以及磷酸化c-fos的表达没有显著影响;牵张力刺激前1小时，Curcumin(10uM)孵育细胞，继之10％牵张力刺激细胞6小时，发现ACE2mRNA和蛋白质的表达较单纯牵张力组均明显降低（P＜0.05）;10％牵张力刺激平滑肌细胞0小时、1小时、3小时、6小时，收集细胞提取核蛋白，利用EMSA技术检测牵张力对AP-1DNA结合能力的影响，结果显示10％牵张力增强AP-1的DNA结合能力，利用AP-1的冷竞争探针能抑制牵张力诱导的AP-1的DNA结合能力;免疫荧光染色显示10％牵张力促进c-jun的核转位，而不影响c-fos的核移位。
　　 4.NF-κB参与牵张力(10％elongation，1Hz)对HASMCsACE2mRNA、蛋白表达的调控
　　 给予平滑肌细胞10％周期性牵张力刺激15分钟、30分钟、1小时、2小时，收集细胞提取胞浆蛋白，Westernblot检测p65，磷酸化p65的表达，结果显示牵张力干预细胞1小时，磷酸化p65的表达升高达到峰值并维持到2小时;给予平滑肌细胞SN50预孵育1小时，继之以10％牵张力刺激6小时，Westernblot及实时荧光定量PCR结果显示:SN50组较单纯的牵张力干预组ACE2的蛋白及mRNA表达水平进一步升高(P＜0.05）;10％牵张力刺激平滑肌细胞0小时、1小时、3小时、6小时，提取细胞核蛋白，EMSA测定10％牵张力对NF-κBDNA结合能力的影响，结果显示:与静态对照组相比，牵张力干预组细胞NF-κB的DNA结合能力明显增强，NF-κB抑制剂SN50和NF-κB冷竞争探针能有效抑制NF-κB的DNA结合能力。
　　 5.Sp-1未参与调节牵张力(10％elongation，1Hz)介导的HASMCs对ACE2mRNA、蛋白表达变化
　　 分别给予平滑肌细胞10％周期性牵张力刺激15分钟、30分钟、1小时、2小时，收集细胞提取胞浆蛋白，Westernblot检测Sp-1以及磷酸化Sp-1的表达，结果显示牵张力刺激HASMCs15分钟，磷酸化Sp-1的表达明显升高，于1小时达峰，总Sp-1没有显著变化;利用Sp-1药理学抑制剂WP631（100nM）预处理细胞1小时，然后再给予10％牵张力刺激6小时，收集细胞提取RNA和蛋白，Westernblot及实时荧光定量PCR结果显示:单纯牵张力明显上调HASMCsACE2的蛋白和mRNA表达水平，WP631对牵张力介导的ACE2的蛋白和mRNA表达改变没有显著影响(P＞0.05)。
　　 6.PKC-βⅡ对牵张力(10％elongation，1Hz)介导的NF-κB/ACE2、AP-1/ACE2信号转导通路的影响
　　 10％周期性牵张力分别刺激人主动脉平滑肌细胞15分钟、30分钟、1小时、2小时，Westernblot检测PKCβⅡ以及磷酸化PKCβⅡ的表达，结果显示10％牵张力干预HASMCs15min后，磷酸化PKCβⅡ表达明显升高，升高趋势持续到2h;给予HASMCsPKCβⅡ药理学抑制剂CG53353(100nM)预处理1小时，继之给予10％牵张力刺激6小时，收集细胞提取RNA和蛋白，Westernblot及实时荧光定量PCR结果显示:牵张力明显上调HASMCsACE2的蛋白和mRNA表达水平(P＜0.01)，CG53353部分抵消牵张力上调ACE2蛋白和mRNA表达的作用(P＜0.01);CG53353（100nM）预处理1小时，继之给予10％牵张力刺激3小时，提取核蛋白，EMSA测定AP-1及NF-κB的DNA结合能力，结果发现，抑制PKCβⅡ的活性，有效抑制牵张力对AP-1、NF-κB活性的激活。
　　 7.Akt信号通路对牵张力(10％elongation，1Hz)介导的血管平滑肌细胞ACE2表达的影响
　　 10％周期性牵张力分别刺激人主动脉平滑肌细胞15分钟、30分钟、1小时、2小时，Westernblot检测Akt以及磷酸化Akt的表达，结果显示，牵张力干预HASMCs30min后，磷酸化Akt表达显著升高;给予HASMCsAkt信号通路抑制剂LY294002(50μM)预孵育1小时，继之以10％牵张力刺激6小时，收集细胞提取RNA和蛋白，Westernbiot及实时荧光定量PCR结果显示:10％牵张力上调平滑肌细胞ACE2蛋白及mRNA表达，LY294002对牵张力的这种上调作用没有显著影响（P＞0.05）。
　　 8.ERK1/2信号通路对生理牵张力(10％elongation，1Hz)调节平滑肌细胞ACE2表达的影响
　　 10％周期性牵张力分别刺激HASMCs15分钟、30分钟、1小时、2小时，Westernblot检测ERK1/2以及磷酸化ERK1/2的表达，结果显示，牵张力刺激细胞15分钟后，磷酸化ERK1/2表达明显增加，刺激2小时后，磷酸化ERK1/2水平恢复至静态对照组水平;预先给予HASMCsERK1/2信号通路抑制剂PD98059(30uM)处理1小时，然后给予10％周期性牵张力刺激6小时，Westernblot及实时荧光定量PCR观察ACE2蛋白及mRNA表达水平，结果显示，PD98059干预组ACE2表达水平与单纯牵张力组没有显著差异(P＞0.05)，均高于对照组水平。
　　 9.p38MAPK对牵张力(10％elongation，1Hz)介导的NF-κB/ACE2、AP-1/ACE2信号转导通路的影响
　　 采用10％周期性牵张力分别刺激HASMCs15分钟、30分钟、1小时、2小时，Westernblot检测p38以及磷酸化p38的表达，结果显示磷酸化p38自牵张力刺激15分钟开始升高，30分钟达到高峰，1小时恢复静态对照组水平;给予HASMCsp38药理学抑制剂SB203580(10μM)处理1小时，然后给予10％周期性牵张力刺激6小时，Westernblot及实时荧光定量PCR观察ACE2蛋白及mRNA表达水平，结果显示，10％周期性牵张力显著上调ACE2表达，SB203580预处理对牵张力诱导的ACE2表达上调没有抑制作用（P＞0.05）。
　　 10.JNK1/2对牵张力(10％elongation，1Hz)介导的NF-κB/ACE2、AP-1/ACE2信号转导通路的影响
　　 给予HASMCs10％周期性牵张力分别刺激HASMCs15分钟、30分钟、1小时、2小时，Westernblot检测JNK1/2以及磷酸化JNK1/2的表达，结果显示磷酸化JNK1/2自牵张力刺激15分钟开始升高，30分钟达到高峰，1小时恢复静态对照组水平;利用JNK1/2药理学抑制剂SP600125(20μM)预处理HASMCs1小时，然后再给予10％周期性牵张力刺激6小时，Westernblot及实时荧光定量PCR观察ACE2蛋白及mRNA表达水平，结果显示，10％周期性牵张力显著上调ACE2表达(P＜0.01)，而SP600125预处理对10％牵张力诱导平滑肌细胞ACE2表达有明显的抑制作用(P＜0.01);SP600125（20μM）预处理1小时，继之给予10％牵张力刺激3小时，提取核蛋白，EMSA测定AP-1、NF-κB的DNA结合活性，结果发现，抑制JNK1/2的活性，能有效消减牵张力对AP-1、NF-κβ活性的激活。
　　 结论：
　　 1.牵张力通过增强AP-1与DNA结合的活性提高血管平滑肌细胞ACE2的表达。通过增强NF-κB与DNA结合的活性抑制血管平滑肌细胞ACE2的表达。
　　 2.牵张力可以通过JNK1/2、PKC-βⅡ活化调节血管平滑肌细胞ACE2的表达。
　　 总之，牵张力通过JNK1/2、PKC-βⅡ、NF-κB、AP-1信号途径调节血管平滑肌细胞ACE2的表达及其活性。