半胱氨酸双加氧酶及其模型化合物催化反应机理和活性调控机制的理论研究

摘要

单核非血红素铁酶是一类重要的金属蛋白酶，它参与许多重要的需氧的生化反应。在自然界中，好氧生物需要利用氧气为其生命过程提供能量并完成各种新陈代谢过程。但是，大气中氧分子的基态为三重态，而被氧化的有机底物的基态一般为单重态，这是一个自旋禁阻的反应过程。一方面，这意味着所有的有机物自发燃烧为二氧化碳和水是一个禁阻的过程；而另一方面，自旋禁阻也导致三重态的氧气参加的反应是一个相当缓慢的动力学过程。在这种情况下，含有过渡金属的氧活化酶被用来解决这一问题。这些金属蛋白酶可以高选择性地催化和控制生物体内各种有机物的氧化过程，并且它们活性中心的结构可以随着催化功能的不同而发生变化。理解这些酶的催化反应机理和氧气激活的活性调控机制是当前国际学术研究的热点和前沿。
　　 半胱氨酸双加氧酶(CDO)是一种单核非血红素金属蛋白酶，在哺乳动物细胞内被发现，在肝细胞内尤其丰富。CDO在新陈代谢和生物转化中起着关键作用。CDO催化半胱氨酸(Cys)的氧化反应生成半胱亚磺酸，这是Cys分解代谢过程的第一步，在下一步的氧化过程中生成硫酸盐或者牛磺酸。CDO对于维持生物体的健康有重要作用。
　　 CDO是一种新颖的单核非血红素金属蛋白酶。在单核非血红素金属蛋白酶中，它的反应活性中心的典型结构是2－组氨酸－1－羧酸盐的面型三联体结构。然而，在CDO中，第三个组氨酸咪唑基团取代了羧酸盐配体的位置，形成了3－组氨酸面型三联体结构。另外，Cys中的硫醇硫与附近的酪氨酸残基中的C形成了一个硫醚键，这种罕见的Tyr－Cys结构被称为“交联蛋白辅因子”。CDO的这些结构特性可能会对它的催化机理产生影响。
　　 相比于CDO的重要性，人们对这种非血红素酶的反应机理却知之甚少，且对提出的反应机理也存在诸多争论。因为CDO的催化反应进行地非常快，因此利用实验手段很难捕捉到反应过程中相关的中间体，这就为进一步了解CDO带来了困难。分子水平上的理论计算研究就显得尤为重要，开展相关的理论研究工作是当今理论化学工作者面临的一项重要任务。
　　 在本论文中，我们采用密度泛函理论方法，对CDO及其模型化合物催化反应机理和活性调控机制进行了理论研究，内容涵盖了CDO的催化反应机理，氧气激活机制以及CDO及其模型化合物的电子结构特性和电荷转移路径等。本论文主要创新成果如下：
　　 1.用密度泛函方法详细地研究了CDO催化Cys的反应机理。我们以大鼠CDO(PDB ID：3ELN)的X射线晶体结构为初始构型，选取了包含组氨酸(His86，His88和His140)，底物Cys和双氧分子在内的铁的反应活性中心作为模型，讨论了在单重态、三重态和五重态下，反应路径中关键点的几何构型和电子结构，并给出了势能面。通过研究，我们提出了新的CDO反应机理，即“铁近端氧”反应机理。
　　 结果表明：在这个反应机理中，反应由五步组成。首先，位于Fe和S之间的O(1)－O(2)键的摆动使得铁近端氧原子O(1)接近S，而铁远端氧原子O(2)靠近Fe，这步反应经过过渡态TS1生成了七元环中间体INT2。接着，随着O(1)－O(2)键的断裂和S－O(1)键的分子内旋转，第二个氧原子O(2)被转移到底物的S中，反应结束并生成产物半胱亚磺酸。
　　 CDO的反应主要发生在高自旋五重态的势能面上，决速步的活化能为15.7kcal.mol-1。结合五重态势能面上各个关键点的电子结构变化，我们了解到：在第一步O(1)－O(2)键的摆动过程中，一个电子从π*oo轨道迁移到σ*x2-y2轨道中。5INT2的电子组态为π*xy2π*xz1π*yz1σ*z21σ*x2-y21，其中Fe的氧化态为Ⅱ。在第二步反应中，O(1)-O(2)键的伸长和断裂导致了中间体5INT3的生成，在这个化合物中，S原子具有自由基特性(ps=0.46)，这主要是由于S原子孤对电子中的一个电子转移到O(1)原子上造成的。与此同时，Fe转移了一个电子到O(2)原子上，Fe的氧化态由5INT2中的Ⅱ变为了5INT3中的Ⅲ。在第三步反应中，前两步反应提供了足够的空间，S-O(1)键的分子内旋转生成了中间体5INT4。在最后两步反应中，一个电子从硫氧化物迁移到Fe-oxo体系中，生成了产物半胱亚磺酸，同时CDO中Fe的氧化态又变为Ⅱ。
　　 “铁近端氧”反应机理是一个伴随大量放热的分步反应机理。与之前de Visser课题组提出的“铁远端氧”反应机理相比，这两个机理都是可行的，有竞争力的反应机理。本研究为人们进一步了解CDO催化反应机理提供了参考。
　　 有关结果被杂志Journal of Theoretical and Computational Chemistry接收。
　　 2.用密度泛函方法详细地研究了CDO模型化合物在氧化反应过程中氧气的激活模式，通过分析电子结构、成键类型和前线轨道，对硫醇配体及其相对位置是如何控制氧气激活的进行了理论研究。我们选取了四个模型：两个硫醇配体化合物[(iPrBIP)FeⅡ(SPh)(Cl)](A)和[(iPrBIP)FeⅡ(SPh)(OTf)](B)，两个非硫醇配体化合物[(iPrBIP)FeⅡ(Cl)2](C)和[(iPrBIP)FeⅡ(OTf)2](D)。在硫醇配体化合物中，相对于Fe的第六个开放位点，模型(A)的硫醇配体位于反式位置，而模型(B)的硫醇配体位于顺式位置。另外，我们也研究了氧气激活的两个关键点：第一个关键点是氧气结合到Fe的开放位点之前，这可以反映氧气激活的本质特性；第二个关键点是氧气恰好结合到开放位点，而这可以反映氧气和模型的相互作用。
　　 结果表明：硫醇配体对氧气的激活是至关重要的，而且它的相对位置对决定氧气激活路径也有重要的影响。在硫醇配体模型中，通过有效的相互作用，硫醇配体可以同时作为π给体和σ给体向FeⅡ转移电荷。一方面，这降低了FeⅡ的有效核电荷和氧化还原势；另一方面，通过降低结构的Lewis酸性，较强的电子给予能力降低了氧气分子的结合能。硫醇配体为氧气的激活提供了必要条件。硫醇配体的相对位置也对氧气的激活起着重要的作用。当硫醇配体结合到反式位置时，Fe的d轨道将会成为最高占据轨道，并作为σ给体向O(1)2p轨道转移电荷，这将导致Fe的氧化和Fe-S键的断裂。当硫醇配体结合到顺式位置时，S的π分子轨道将占据最高双占据轨道，并作为σ给体向O(2)转移电荷，从而导致硫醇配体中的S发生氧化反应。
　　 结合实验数据，我们关联了这四个(iPrBIP)FeⅡ化合物的氧化还原电势和在反应过程中的电荷转移量。结果发现，硫醇配体的电荷转移量和相关的氧化还原势是密切相关的。电荷转移量越多，氧化还原势越低。这意味着我们可以通过调整配体的电荷转移能力来改进相关的模型。
　　 本研究为进一步了解CDO氧气激活机制提供了理论依据。
　　 有关结果发表在J.Phys.Chem.A(2012，116，5510-5517)杂志上。
　　 3.用密度泛函方法详细地研究了CDO模型化合物和反应活性中心以及它们相应的硒代化合物，在通过氧气激活进行催化反应的前两步反应中，通过分析成键类型，前线轨道和电荷转移路径，对为什么CDO不能催化Sec的氧化而可以催化Cys的氧化的问题进行了理论研究，尽管Se的电荷转移能力要强于S。我们选取了两个模型：一个CDO模型化合物和一个CDO反应活性中心(PDB ID：3ELN)。根据文献已经报道出的CDO催化机理，对前两步反应过程中公认的三个关键点结构A，B和C进行了研究。它们分别是氧气结合到Fe的第六个开放位点之前的结构A，氧气恰好结合到开放位点的结构B和氧气进攻S生成四元环的结构C。
　　 结果表明：在O2结合过程的第一步反应中，CDO硒代化合物中Se向Fe转移电荷的能力要强于S。以CDO模型化合物为例，在结构A中，自旋向上的电子成单地占据在Fe的四个d轨道中，Fe的氧化态为Ⅱ。当结合了O2，在结构B中，Fe将d轨道中的电荷转移到OOπ*轨道中，Fe的氧化态变为Ⅲ。这个结构与三价铁过氧化物的特性一致。而在Se-CDO模型化合物中，Fe也将d轨道中的电荷转移到OOπ*轨道中，但由于Se更好的电荷转移能力，它可以通过将Se4p轨道的电荷转移到Fe的d轨道来补偿Fe中心的电荷损失。这样，在Se-CDO模型化合物的结构B中，Fe的氧化态保持Ⅱ。
　　 在第二步反应，四元环结构的形成过程中，S的电荷给予能量强于Se。随着四元环结构的形成，S(Se)-O(2)键生成，同时Fe-O(1)键被削弱。在CDO模型化合物的结构C中，一方面，S将S3p轨道的电荷转移到OOπ*轨道，与OOπ*轨道中的一个电子配对；另一方面，S可以向Fe的d轨道转移电荷。在这个过程中，Fe的氧化态重新变为Ⅱ。而在Se-CDO模型化合物的结构C中，相比于Fe-S键，Fe-Se键被更大地削弱了，Se只将Se4p轨道的电荷转移到OOπ*轨道，而不是转移给Fe。在反应过程中，Fe始终保持Ⅱ价的氧化态。
　　 与模型化合物相似，在CDO反应活性中心中，Fe中心氧化态的变化是Ⅱ→Ⅲ→Ⅱ，而在Se-CDO反应活性中心中，Fe中心的氧化态始终保持Ⅱ价。
　　 在催化反应的前两步反应中，S和Se之间的电荷转移竞争导致了Fe中心氧化态的不同变化。考虑到三价铁过氧化物是这类反应中的活性氧化剂，所以，半胱氨酸化合物的Fe中心可以有效地催化O(1)-O(2)键的断裂，而硒代半胱氨酸化合物中Fe中心则不能。以上研究结果有助于解释为什么CDO不能催化Sec的氧化而可以催化Cys的氧化。
　　 有关结果发表提交到Journal of Inorganic Biochemistry上。