XPA在肺癌组织中的表达及沉默XPA基因对A549/DDP化疗敏感性的影响

摘要

支气管肺癌是呼吸系统最常见的恶性肿瘤之一。在最近几年，由于环境污染日益严重、吸烟人数和吸烟量逐渐增多，全世界范围内肺癌的发病率和病死率也在发生变化，正处在日益增长的过程中。有数据显示，近年肺癌的发病率全世界范围内已经约达万分之七，居于恶性肿瘤发病率的首位，这与我国肺癌发病率的现状是相吻合的。日前有资料显示，约半数以上的癌症患者死亡或无疗效的原因与存在肿瘤耐药有着直接或间接的关系。
　　 目前，化疗方案中作为一线化疗标准方案的仍然是铂类与第3代细胞毒性药物的联合化疗方案。顺铂是多种晚期肿瘤使用最为广泛的化疗药物，几乎所有一线非小细胞肺癌化疗都是与顺铂联合应用的方案。与最佳支持治疗相比，含铂类药物的联合化疗方案能明显改善和控制患者临床症状，延长其中位生存期，提高生活质量。然而由于癌细胞原发或继发的铂类耐药而削弱顺铂的化疗疗效。由于肺癌的耐药机制是极其复杂的，是由多因素、多因子参与的过程，因此对其进行深入研究是具有重要意义的。
　　 耐顺铂人肺腺癌细胞株A549/DDP与人肺腺癌细胞株A549来自同一亲本，具有相同的遗传背景，两者之间存在对顺铂敏感性和耐药性的不同，因此采用这两种细胞株进行研究可避免取样时造成的组织学差异，这样才能对于所筛选的各基因之间的关系进行全面、准确地反映。也就是说，选择耐顺铂人肺腺癌细胞株A549/DDP细胞为材料，可基本初步确定肺腺癌顺铂耐药的相关候选基因，进而深入探讨肺癌的耐药机制。
　　 核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER)是细胞内最重要的DNA损伤修复方式之一，但是如果增强DNA损伤的修复能力，则又易引起肿瘤细胞的耐药。目前在NER与肿瘤发生及耐药之间关系的研究方面取得了重大进展。
　　 近几年来，RNA干扰技术是在生命科学领域中新兴的一门技术，这是一种序列特异性的转录后沉默，产生的效应类似于基因敲除，目前已成为进行基因功能研究的一种重要手段。在筛选出的与肺癌耐药相关的差异表达基因中，选择表达明显上调的基因，然后利用此技术封闭耐顺铂人肺腺癌细胞A549/DDP细胞株中该特异基因的表达，通过逆转其耐药性为探索提高肺癌铂类药物化疗效果的有效策略提供理论基础。
　　 我们的研究通过揭示XPA在非小细胞肺癌对顺铂耐药过程中的作用，进一步阐述肺癌对化疗的耐药机制，探讨沉默着色性干皮病A(XPA)基因表达在非小细胞肺癌耐药细胞株顺铂化疗敏感性的影响。
　　 方法：采用免疫组织化学法、实时定量PCR(qPCR)及免疫印迹(Western blot)方法检测非小细胞肺癌患者肿瘤组织中XPA-mRNA及其蛋白的表达情况。应用qPCR及Western blot方法检测耐顺铂人肺腺癌细胞株A549/DDP细胞经XPA-shRNA质粒转染后XPA-mRNA及其蛋白的表达水平。通过MTT法检测沉默XPA基因后A549/DDP的细胞凋亡情况及其对顺铂的敏感性。
　　 结果：
　　 1.肺癌及癌旁组织XPA表达免疫组化染色显示，肺腺癌组织胞浆及胞核均表达XPA，鳞癌组织主要表达在胞浆内。IOD分析显示，与癌旁组织比较，肺腺癌及鳞癌组织XPA表达均明显增高。
　　 2.肺癌及癌旁组织XPA-mRNA及蛋白表达qPCR显示肺腺癌及鳞癌组织XPA-mRNA表达均显著高于相应的癌旁组织。Western blot结果显示，与癌旁组织比较，肺腺癌及鳞癌组织XPA蛋白表达亦明显增高。
　　 3.沉默A549/DDP细胞株XPA基因效果检测qPCR及Western blot结果显示，A549/DDP细胞株经XPA-shRNA质粒转染后XPA-mRNA及蛋白的表达均较未处理组明显降低。
　　 4.XPA基因表达水平对A549/DDP细胞凋亡的影响MTT法测定A549/DDP细胞转染XPA-shRNA后A549/DDP细胞对顺铂的敏感性增加。空白组与对照组比较差异无统计学意义；转染组与空白组、对照组相比，差异有统计学意义。
　　 结论：
　　 1.XPA在肺腺癌和肺鳞癌组织中有较高的表达水平。
　　 2.沉默XPA可以促进A549/DDP细胞凋亡，提示XPA与促进A549/DDP细胞增殖及其抑制A549/DDP细胞凋亡有关，进一步提示沉默XPA基因可以逆转非小细胞肺癌对顺铂的耐药。