人凝血因子Ⅷ分离纯化工艺研究

摘要

人凝血因子Ⅷ(human coagulation factorⅧ，FⅧ)是人血浆中一种非常重要的凝血因子，其缺失或缺乏会引起不同程度的甲型血友病--一种X连锁隐性遗传的出血性疾病，严重时甚至会危及患者的生命。甲型血友病是一种终生性疾病，目前仍没有根治的方法，只能通过输注FⅧ产品进行替代性治疗。只要能及时输注FⅧ产品，甲型血友病患者也能如正常人一般生活甚至参加激烈的体育运动。但是目前国内市场上的FⅧ产品严重不足，不能充分供给国内甲型血友病患者的使用，经常会出现断药的情况，危害国内患者的健康和生命安全。
　　 FⅧ是已有国家标准药，随着国内经济收入的逐年增长以及蛋白分离技术的飞速发展，国内已有少数几个厂家开始生产FⅧ产品，我们泰邦公司也开始开发FⅧ的分离纯化工艺，以期能为血友病患者提供更多安全、有效的药品。
　　 FⅧ分子结构复杂，分子量为330kDa，是一种较大的血浆蛋白分子。但在血浆中的含量仅为0.1-0.2μg/ml，半衰期约为12 h，因此其提取技术非常困难。我们经过大量的实验数据摸索，以及生产规模放大试产，得出了一条较为可行的FⅧ生产工艺：以人新鲜冰冻血浆低温离心后冷沉淀为起始原料，用适量的肝素钠溶解液溶解，在适当的温度条件下降低溶解液pH，沉淀大部分的纤维蛋白原和纤维结合蛋白；离心收获上清液，进行6 h有机溶剂/去污剂(solvent/detergent，S/D)病毒灭活：进行Toyopearl DEAE650M弱阴离子交换层析，先用洗涤液洗去大量的杂蛋白，然后用合适的洗脱液洗脱收集FⅧ；洗脱液经超滤透析后配制至适当的规格，进行冷冻干燥，冻干后制品经100℃30min干热灭活，得FⅧ成品。
　　 本工艺生产的FⅧ产品目前已经完成临床实验，临床实验结果良好，治疗后患者血液中FⅧ活性水平有明显升高，用药后10 min FⅧ：C达到161.89％，用药后1 h达到112.98％；并且治疗后临床症状有较大改善，其改善率达到93％(其中优良31.6％，改善61.4％)。
　　 根据中国食品药品检定研究院的检验结果，本工艺生产的FⅧ产品多项指标均优于《中国药典》的最低标准规定，已有检测项目均高于《欧洲药典》的最低标准规定。送检三批产品复溶时间都不高于2 min，仅为《中国药典》规定的1/15；比活性更是高达≥41.7IU/mg蛋白，高于《中国药典》规定的41.7倍；抗A、抗B血凝素不高于1:4，仅为《中国药典》规定的1/16，聚山梨酯-80残留量不高于61μg/ml，为《中国药典》规定的1/16，磷酸三丁酯残留量不高于3μg/ml，低于《中国药典》规定的1/3。与市售FⅧ产品的质量对比，本工艺生产的FⅧ产品各项质控指标均不低于市售产品水平。
　　 按照年投浆量300吨计算，本工艺每年可以生产200IU/瓶的FⅧ产品15万瓶，在创造产值5000万的同时，可以为血友病患者提供3000万砌的FⅧ，能极大的缓解国内用药紧张的局面。