人血浆中凝血因子Ⅷ的分离纯化

摘要

凝血因子Ⅷ(FⅧ)作为血友病患者维持生命的必须药品，原料来源是人类血浆，而我国血浆供应不足的状况造成FⅧ制品供应严重不足，因此，改进从人血浆中分离纯化FⅧ的生产工艺，提高国内产量是十分必要的。
　　 本文以血浆冷沉淀为基础，采用层析法分离FⅧ;比较了凝胶过滤、离子交换层析、疏水层析三种层析法从冷沉淀溶液中分离FⅧ的效果，从活性收率和纯化倍数两个方面比较得出疏水层析对FⅧ这种大分子强疏水性蛋白有较好分离效果;且疏水分离机制利于保持FⅧ活性;并通过制一系列不同配基密度的介质以证实低配基密度介质有利于在层析过程中保持大分子蛋白活性这一现象。
　　 在此基础上对疏水层析分离条件进行优化，最终确定层析条件如下:
　　 疏水介质:Phenyl sepharose 6FF，配基密度20μ mol/ml介质;
　　 上样量:冷沉淀溶液二次离心后上清（13.66mg蛋白/ml介质）;
　　 上样流速:1ml/min;
　　 洗脱方式:0～100％B液线性洗脱5个柱体积;
　　 反应温度:25℃
　　 A液:20mM柠檬酸缓冲液+1mM氯化钙+120mM甘氨酸+1M硫酸铵，pH6.6;
　　 B液:20mM柠檬酸缓冲液+1mM氯化钙+120mM甘氨酸，pH6.6。
　　 最终得到洗脱峰中FⅧ活性收率62％，相对于原血浆纯化倍数96倍，证明了在优化后的层析条件下可以获得高浓度的FⅧ样品，使用低配基密度介质利于保持目标蛋白活性，为进一步生产FⅧ制剂打基础。

目录

声明

学位论文数据集

摘要

第一章 绪论

1．1 凝血因子Ⅷ及凝血因子Ⅷ制品

1．1．1 凝血因子Ⅷ简介

1．1．2 凝血因子Ⅷ制品

1．1．3 凝血因子Ⅷ制品的病毒灭活

1．1．4 F Ⅷ活性效价的测定方法

1．1．5 FⅧ市场概况

1．2 层析法分离血浆蛋白

1．3 本论文研究内容

1．3．1 本课题研究意义

1．3．2 本课题研究的主要内容

第二章 人血浆中凝血因子Ⅷ的分离纯化

2．1 实验试剂和仪器

2．1．1 实验试剂

2．1．2 实验仪器

2．2 实验方法和步骤

2．2．1 蛋白质浓度测定方法

2．2．2 F Ⅷ活性的测定

2．2．3 凝胶过滤高效液相(HPLC)分析

2．2．4 SDS-PAGE电泳

2．2．5 冷沉淀

2．2．6 硫酸铵沉淀

2．2．7 阴离子交换介质层析分离工艺

2．2．8 静态筛选疏水层析介质

2．2．9 疏水层析工艺

2．2．10 评价指标

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 硫酸铵沉淀实验结果

2．3．2 凝胶过滤结果

2．3．3 离子交换层析结果

2．3．4 疏水层析结果

第三章 结论与展望

3．1 结论

3．2 本论文创新点

3．3 展望

参考文献

致谢

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