新型玻璃化液冻存乳鼠卵巢器官的遗传安全性和生育力保存研究

摘要

实验一幼鼠卵巢的两种玻璃化冷冻程式研究
　　 目的：低浓度和低毒性玻璃化溶液配置和适宜的玻璃化冷冻程式是成功实施卵巢玻璃化冷冻，恢复卵巢功能的关键。本课题第一部分应用自主创新的在前期冻存大鼠、绵羊卵巢组织时都取得良好冷冻效果的玻璃化液-EG5.5/30，在国内首次通过观察乳鼠卵巢器官在不同玻璃化液的渗透行为来设计适宜乳鼠卵巢玻璃化冻存的冷冻程式，比较两种玻璃化液对乳鼠卵巢器官的冷冻效果，优选出适合乳鼠卵巢器官的玻璃化冷冻方案。
　　 方法：出生12d乳鼠性成熟前卵巢，随机分为新鲜对照组(n=18)，ED20玻璃化液冻存组(n=24)，EG5.5/30液冻存玻璃化组(n=24)。两玻璃化液冻存组应用EG5.5/30、ED20液冻存处理。乳鼠卵巢在冻存前经过两种玻璃化液的预渗透平衡处理，倒置显微镜下通过在不同的时间点拍照，测量卵巢的渗透表面积来观察乳鼠卵巢器官在不同玻璃化液的渗透行为；新鲜和冻融卵巢通过荧光活力检测卵子的存活率，α-tubulin的免疫荧光激光共聚焦显微镜观察和分析卵子内细胞骨架(微丝和微管)的结构和数量变化比较两种玻璃化液的冷冻效果。
　　 结果：乳鼠卵巢在两种玻璃化液的预平衡液渗透平衡的15min中，表面积均持续缩小，幅度渐慢，进入ED20和EG5.5/30两种玻璃化液后，高渗抽提，表面积再次剧烈皱缩。在ED20液内渗透平衡2min时27.7％的渗透脱水率和在EG5.5/30液内渗透平衡4min时23.1％的渗透脱水率被确定为最佳渗透脱水状态。玻璃化冷冻和复苏后，乳鼠卵巢内大量始基卵泡保存了高于80％的卵子存活率(87％，403/464；84.6％，419/495)但两冷冻组均显著低于新鲜移植组(92.6％，365/394，p<0.05)；α-tubulin的免疫荧光激光共聚焦分析显示，两玻璃化液冻融的卵子内细胞骨架微丝和微管结构受损，荧光强度均显著低于新鲜组(p<0.05)；但卵子存活率、微丝和微管的荧光强度在两玻璃化液冻存组均无显著性差异(P>0.05)。
　　 结论：新型玻璃化液(EG5.5/30)冷冻效果与ED20液相当，均适宜乳鼠卵巢器官的玻璃化冻存。通过观察卵巢在玻璃化液内的渗透脱水行为，可以帮助我们成功设计玻璃化冷冻程式。
　　 实验二玻璃化冷冻对乳鼠卵巢印记基因H19/Snrpn的甲基化影响研究
　　 目的：玻璃化冷冻体外操作的特性，以及玻璃化冷冻依赖高浓度冷冻保护液，不可避免地带来毒性和渗透损伤是否对卵子发育过程中印记基因的甲基化印记建立和维持产生不利影响，从而影响其卵子和胚胎的继续发育、成熟，带来遗传安全隐患问题。本课题部分在国内首次进行玻璃化冷冻对乳鼠卵巢印记基因H19、Snrpn甲基化影响以及影响机制的系列基础研究，惠于不孕不育人群的生殖健康和后代人口素质。
　　 方法：两种玻璃化液冻融处理乳鼠卵巢后，156枚乳鼠卵巢随机分为新鲜组，ED20液冻存组，EG5.5/30冻存组(n=52×3)，提取卵巢组织的DNA，以新鲜组为对照，通过重亚硫酸盐DNA测序(BSP)方法分析玻璃化冻融后卵巢组织父本印记基因H19和母本印记基因Snrpn差异甲基化区(DMR)的甲基化状态变化；提取玻璃化冻融前后卵巢组织的RNA，逆转录为cDNA，通过RT-PCR技术分析H19和Snrpn的mRNA表达水平变化；免疫组织化学法检测DNA甲基化关键调控酶Dnmt1和IGF-2蛋白在玻璃化冻融前后卵巢组织卵泡中的表达变化。
　　 结果：与新鲜对照组相比，玻璃化冻融后，无论是ED20液冻存组还是EG5.5/30液冻存组，乳鼠卵巢组织父本印记基因H19-DMR的甲基化比例均显著增高(p<0.05)，EG5.5/30液冻存组H19-DMR的甲基化比例亦显著高于ED20液冻存组(p<0.05)；与新鲜对照组比较，ED20液冻存组和EG5.5/30液冻存组乳鼠卵巢组织母源印记基因Snrpn-DMR的甲基化比例均显著降低(p<0.05)，但两玻璃化液冻存组间无显著性差异(p>0.05)；玻璃化冻融后，ED20液冻存组和EG5.5/30液冻存组乳鼠卵巢组织H19mRNA水平均降低表达，但与新鲜组均无显著性差异(p>0.05)，两玻璃化液冻存组间亦无显著性差异(p>0.05)；SnrpnmRNA在新鲜组和两玻璃化液组乳鼠卵巢组织中均未见表达；Dnmt1和IGF-2蛋白均在玻璃化冻融前后的乳鼠卵巢组织各级卵泡的颗粒细胞及卵母细胞胞核表达。Dnmt1蛋白在冻融后的卵巢组织卵泡内表达下降，ED20液冻存组和EG5.5/30液冻存组均较新鲜组表达显著降低(p<0.05)，两玻璃化液冻存组间无显著性差异(p>0.05)；IGF-2蛋白在冻融后的卵巢组织卵泡内表达增加，ED20液冻存组和EG5.5/30液冻存组均高于新鲜组，但只有EG5.5/30液组与新鲜组比较具有统计学意义(P<0.05)，ED20液组与新鲜组比较不具有统计学意义(P>0.05)，ED20液组与EG5.5/30液组之间无统计学差异(P>0.05)。
　　 结论：玻璃化冷冻对乳鼠卵巢的H19、Snrpn的DNA甲基化印记产生不利影响，可能影响到卵子发生阶段印记基因甲基化模式的建立和维持。玻璃化冷冻损伤DNA甲基化的关键调控酶Dnmt1的活性，造成玻璃化冻融后卵巢组织母源印记基因Snrpn低度甲基化，父源印记基因H19高度甲基化和IGF-2蛋白在原始、初级卵泡的表达显著增加等表观遗传修饰异常。
　　 实验三玻璃化冻融乳鼠卵巢异体移植后继续发育和生殖潜能研究
　　 目的：探讨玻璃化冻存乳鼠卵巢复苏后异体移植对卵母细胞生长发育、成熟、受精和进一步胚胎发育潜能的影响。
　　 方法：将100只性成熟前乳鼠卵巢进行两种玻璃化液的冻存，复苏后进行成年去势雌鼠的肾被膜下移植。卵巢标本随机分为新鲜移植组(39只)、ED20玻璃化液冻存移植组(32只)和EG5.5/30玻璃化液冻存移植组(29只)。术后15天，通过动情周期恢复、卵巢存活率和雌激素水平判断移植卵巢在受体体内继续发育情况；超排卵收集成熟卵母细胞用于体外受精和早期胚胎培养，比较各组受精率和囊胚形成率。
　　 结果：除两玻璃化液冻存移植组动情周期恢复时间均显著迟于新鲜移植组(P<0.05)外，出现动情周期的受体百分率，卵巢存活率及雌二醇水平在三组间均无显著性差异(P>0.05)。超排卵后体外受精，来自两玻璃化液冻存移植组超排的成熟卵子均可以完成体外受精、胚胎分裂和囊胚形成，其卵子的受精率、囊胚形成率与新鲜移植组比较均无显著性差异(P>0.05)。
　　 结论：乳鼠卵巢玻璃化冻融后移植，可以很快恢复卵巢的内分泌和生殖功能。玻璃化冻存乳鼠卵巢不影响卵母细胞的质量和进一步受精、发育至附植前囊胚的潜能，借助超排卵和体外受精技术可产生正常的附植前胚胎。