CD44单克隆抗体A3D8及其与阿糖胞苷联合应用在急性髓细胞性白血病中抗肿瘤机制的研究

摘要

白血病是造血干细胞异常的恶性疾病，白血病细胞失去进一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生积聚并浸润其他器官和组织，同时使正常造血受抑制。根据白血病细胞的成熟程度和自然病程，白血病可分为急性和慢性两大类，其中急性白血病又可分为急性髓细胞性白血病(或急性粒细胞性白血病，acute myeloid leukemia，AML)以及急性淋巴细胞性白血病。AML随着年龄的增长其发病几率也会随之增高。尽管AML发病率相对较低，但是每年仅美国就有约2.1％的癌症病人死于该疾病。在我国，白血病的发病率为2.76/10万，占癌症病人发病率2.6％左右，其中AML的发病率占绝大多数，约为1.5％。
　　 最初人们认为黏附分子对于多细胞组织的形成以及联系细胞与其细胞外机制(ECM)或临近细胞等非常重要。CD44作为细胞表面的一种重要黏附分子，同时也是重要受体，其正常功能是介导淋巴细胞的归巢、淋巴细胞向炎症部位和黏膜相关淋巴组织归位、黏附细胞外基质等。但由于其在白血病细胞以及多种恶性瘤细胞表面都有不同程度表达，同时参与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡以及肿瘤转移等多种作用，并且变异型CD44(CD44v)的高表达与恶性瘤的侵润和转移密切相关，从20世纪末起，CD44已经成为新型肿瘤疗法的新靶点。研究发现，在乳腺癌的生成以及复发的过程中标准型CD44(CD44s)的表达量显著增高。其它多种实体瘤如黑色素瘤、前列腺癌等也都高表达CD44。AML细胞表面同样高表达CD44且不同AML亚型细胞表面表达的CD44亚型也不尽相同。研究CD44的手段主要为单克隆抗体，已有研究发现，使用CD44单克隆抗体能够诱导AML细胞分化或者凋亡，并且使用低浓度单克隆抗体能够改变AML细胞周期，抑制细胞增殖，所以CD44单克隆抗体可以作为治疗AML的一种手段。也有研究表明，使用小分子量HA或可溶性蛋白质，同样能够阻断某些由CD44传导的细胞信号，从而抑制肿瘤的多药耐药性。并且，CD44不仅表达于各种肿瘤细胞表面，也高表达于肿瘤干细胞表面，使用CD44单克隆抗体H90能明显杀伤白血病干细胞。这些证据说明，CD44在AML以及其它肿瘤发生发展以及治疗中十分重要。
　　 除骨髓移植外，细胞分化疗法是近些年来最常用且有效治疗AML的方法。通过维甲酸破坏PML-rarα(15q22的早幼粒白血病基因PML和17q21的维甲酸受体基因rarα)的治疗方法能够有效地治疗AML M3病人。但是，由于其他亚型的AML中并不表达PML-rarα，极大地限制了这种方法在AML中的应用。所以，找到治疗其他AML亚型白血病的方法非常重要，杀伤AML细胞或者白血病干细胞是治疗AML疾病的研究方向。由于AML细胞表面高表达CD44，故选择性靶向CD44是治疗AML的方法之一。CD44单克隆抗体A3D8具有多种治疗AML的活性，包括抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡及分化等。但是，迄今为止，除细胞分化外，A3D8其它抗肿瘤活性机制尚无定论，使其应用始终停留在初始阶段，所以研究A3D8的抗肿瘤机制并且将其应用于临床，对于研究CD44以及治疗AML至关重要。
　　 而且，作为治疗AML的首选化疗药物，阿糖胞苷(Ara-c)在临床已经广泛应用于AML的治疗，但是同时也对病人造成无法忍受的痛苦。通过A3D8靶向CD44提高阿糖胞苷靶向性以降低其用药浓度以及缩短用药时间，是解决这个问题的理想方法。
　　 本课题主要针对CD44单克隆抗体A3D8对AML细胞周期的影响和引起细胞凋亡作用的机制以及A3D8靶向何种CD44进行研究，并进一步研究A3D8提高阿糖胞苷靶向性提高疗效的机制，为AML的治疗研究提供新思路。
　　 本课题的研究内容如下。
　　 1 CD44单克隆抗体A3D8对细胞周期影响的研究试验中通过使用不同浓度CD44单克隆抗体A3D8或透明质酸(HA)处理AML细胞，用台盼兰对细胞进行染色后在显微镜下进行计数，得到细胞在处理后的增殖情况以及细胞毒性作用。结果发现，A3D8对不同亚型AML细胞均有生长抑制作用，但是不同亚型抑制程度不一。但使用HA在同样条件下处理并不能引起AML细胞的生长抑制作用。
　　 采用PI(碘化丙啶)对AML细胞DNA染色后使用流式细胞仪测定细胞周期的分布，结果发现，使用A3D8处理后，AML细胞生长周期停留于DNA合成期，而HA不能改变AML细胞周期。
　　 本课题使用Western blot方法检测处理后AML细胞中相关蛋白的表达水平变化，结果发现两种重要的细胞周期相关蛋白质Bid及P27在各种AML细胞株中表达量均有不同程度提高。然后通过电转染敲除基因的方法将相应小干扰RNA(siRNA)转入AML细胞内，破坏相应蛋白质的功能。结果表明，A3D8产生的细胞生长抑制作用主要通过Bid及P27两种蛋白质进行调控，且由于Bid位于P27的上游，转录后基因沉默试验(post-transcriptional gene silencingand aznsgene silencing，RNAi)同样证明Bid沉默后同时能下调P27蛋白表达水平，反之则不能，故A3D8诱导的细胞生长抑制作用是由Bid调控的。
　　 将细胞核与细胞质分离是研究相应蛋白质在细胞中如何转移的方法之一。试验主要是使用不同的细胞裂解液通过两步不同强度对细胞进行裂解，然后分步分离。本试验通过分离细胞核质后发现经过A3D8处理后，Bid从细胞质转移到细胞核，说明Bid的转位对细胞周期影响十分重要。
　　 2 CD44单克隆抗体A3D8引起细胞凋亡机制的研究(A3D8单独以及与阿糖胞苷联合用药)试验中使用Annexin V法以及检测DNA片段法测定AML细胞凋亡率，结果发现A3D8能够在某些AML细胞如AML M2、M3中引起一定比例细胞凋亡(在NB4细胞以及SKNO-1中分别引起约30％、50％凋亡细胞)。
　　 采用Western blot方法检测处理后AML细胞中相关蛋白质的表达水平变化，结果发现caspase-8被激活，这说明A3D8诱导产生的细胞凋亡作用主要通过死亡受体途径调控，并且研究发现，CD44s表达量越高，细胞凋亡作用越明显。试验中使用caspase-8抑制剂能够抑制约50％由A3D8引起的细胞凋亡，但是caspase-9抑制剂则不能抑制A3D8的凋亡作用，进一步说明此凋亡作用主要通过死亡受体途径调控而不是线粒体途径。
　　 使用共聚焦显微镜考察了细胞内外蛋白质分布情况的变化，以及细胞膜上的脂质筏与Fas在A3D8处理前后的相互作用。经过A3D8处理过的AML细胞表面能够使脂质筏重新分布形成“帽状”微域，并且使Fas同时转位于脂质筏，激活诱导细胞凋亡死亡受体途径中的重要蛋白质caspase-8；并且，采用胆固醇破坏剂甲基化-β-环糊精(MCD)37℃下孵育30 min破坏脂质筏，使用共聚焦显微镜观察或Western blot检测，结果发现MCD破坏脂质筏后，能够抑制A3D8诱导的AML细胞凋亡作用，并且抑制caspase-8的活化，故我们认为A3D8诱导细胞凋亡主要通过细胞表面脂质筏的重新分布活化死亡受体途径而不是通过线粒体途径。
　　 本研究还发现，阿糖胞苷(Ara-c)能够诱导CD4s蛋白表达量的升高是通过Mnk、eIF4E的活化实现的，从而使本身没有CD44s表达的HL-60细胞经过Ara-c处理后CD44s表达量升高。采用共聚焦显微镜观察发现，A3D8与Ara-c联合用药同样在细胞表面使脂质筏重新分布形成“帽状”结构，说明联合用药能够有效扩大A3D8的应用范围。即使某些AML细胞表面不表达CD44s，使用Ara-c后使CD44s表达量增加，达到扩大应用CD44疗法的目的。然后通过电转染敲除基因的方法将Fas相关死亡结构域蛋白质(Fas-Associated protein withDeath Domain，FADD)siRNA转入AML细胞内，破坏死亡受体通路，Western blot结果发现，FADD缺失后能够有效抑制caspase-8的活化，从而抑制AML细胞凋亡，说明脂质筏激活的死亡受体途径在此联合用药中十分重要。siRNA试验以及共聚焦显微镜结果证明，埃兹蛋白(ezrin)与脂质筏的重新分布密切相关。ezrin缺失后同样能够抑制A3D8诱导的细胞凋亡作用。所以我们认为，此联合用药通过ezrin调控脂质筏重新分布形成“帽状”结构，从而激活死亡受体途径，使AML细胞凋亡。通过此联合用药，能够显著降低Ara-c的使用剂量，减少用药时间，同时增加其靶向性，从而降低Ara-c在治疗白血病时对病人造成的痛苦。
　　 本研究取得的成果和结论：
　　 细胞凋亡以及细胞生长抑制是临床化疗药物治疗恶性瘤的重要方法。尽管在AML病人中已经广泛使用化疗药物达到治疗该疾病的目的，但是化疗药物选择性差、对病人造成痛苦以及病人对药物的多药耐药等问题一直困扰着所有研究人员，并且由于无法选择性杀伤白血病干细胞也是无法根治此疾病的原因之一。CD44虽然不是白血病干细胞表面上唯一受体，但是其与AML的发生发展关系密切，所以选择性靶向CD44或有希望成为治疗AML的新方向。
　　 本论文取得的主要创新性成果与结论如下：
　　 (1)A3D8引起的细胞生长抑制作用是由bid进行调控，且需要bid从细胞质转位于细胞核中，从而激活P27。
　　 (2)A3D8诱导的细胞凋亡作用是由脂质筏的重新分布形成“帽状”结构，从而激活Fas诱导的死亡受体途径引起。
　　 (3)A3D8诱导的细胞凋亡主要与CD44s表达量相关，表达量越高，细胞凋亡率越高。
　　 (4)Ara-c能够活化Mnk、eIF4E，从而诱导CD44s蛋白表达量升高。
　　 (5)A3D8与Ara-c联合用药能够提高A3D8的细胞凋亡作用，其机制与A3D8单独用药一致，都是改变脂质筏分布并形成“帽状”结构从而激活死亡受体途径，并且这种凋亡作用与ezrin密切相关。