NLRP3、NLRP1炎性体信号通路在系统性红斑狼疮、炎风湿关节炎免疫机制中的作用

摘要

第一部分
　　 NLRP3、NLRP1炎性体信号通路在系统性红斑狼疮免疫机制中的作用
　　 背景:
　　 系统性红斑狼疮(systemic lupus erythcmatosus，SLE)是一种常见的自身免疫性疾病，可引起皮肤、血液、肾脏、神经系统等多系统损害，以T、B淋巴细胞活化，大量自身抗体生成，补体激活，免疫复合物清除障碍为特征。狼疮肾炎(Lupus Nephritis，LN)是SLE最常见和最严重的临床表现，肾衰竭是SLE死亡最常见的原因。SLE的发病机制目前尚不明确，目前一般认为其发病是遗传、感染、药物、雌激素水平、饮食等多种因素共同作用于机体产生的异常炎症性免疫反应。过去对SLE的研究多集中于适应性免疫方向，近年来随着人们对固有免疫认识的不断深入，固有免疫在自身免疫性疾病中的作用越来越受到重视，研究发现固有免疫和适应性免疫均参与SLE发病机制。
　　 固有免疫又称为非特异性免疫，能快速识别并清除入侵机体的病原微生物，被认为机体防御的第一道防线，参与固有免疫的细胞包括巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、中性粒细胞和上皮细胞等。固有免疫细胞通过模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)识别病原体上的病原相关分子模式(Pathogen associated molecular patten，PAMP)吞噬病原体，进而启动有效的免疫应答。NOD样受体(NOD-like receptor，NLR)为近来研究较多的模式识别受体，NLR属于胞浆型，NOD样受体3(NLRP3)和NOD样受体1(NLRP1)是调节炎性体活化及组装的两个重要受体。在感染等因素诱导下， NLRP3和NLRP1炎性体通过凋亡相关点状蛋白(apoptosis associated speck like protein containing aCARD，ASC)招募半胱氨酸酶1前体(pro caspase-1)，活化caspase-1，形成NLRP3炎性体和NLRP1炎性体，Caspase-1进一步将IL-1和IL-18前体裂解为有活性的IL-(1)β和IL-18，参与炎症反应和调节免疫应答反应。以往对NLRP3、NLRP1炎性体的活化机制及其效应的研究主要集中在固有免疫细胞中，在SLE中的研究尚不多见，故对NLRP3、NLRP1炎性体组分的深入研究将进一步阐明SLE的发病机制，为治疗提供新靶点。
　　 目的:
　　 检测NLRP3、NLRP1炎性体信号通路相关分子在SLE及正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)、粒细胞(granulocyte)、狼疮肾炎(Lupus nephritis，LN)肾组织及正常肾组织中的表达水平，比较其差异性，并检测NLRP3、NLPR1炎性体组分在糖皮质激素治疗前后的变化，探讨NLRP3、NLRP1炎性体信号通路在SLE炎症反应中可能的作用。
　　 方法:
　　 1.详细收集39例SLE患者和31例正常对照者的临床资料，分离PBMC和粒细胞。
　　 2.采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerasechain reaction，RT-qPCR)技术检测NLRP3、NLRP1炎性体在SLE及正常对照组PBMC、粒细胞中mRNA的表达水平，比较其差异性;分析NLRP3、NLRP1炎性体组分与SLE病情活动指标的相关性;并检测下游炎症因子IL-1β mRNA的表达水平。
　　 3.检测SLE患者初次治疗前后（泼尼松60mg/d）NLRP3、NLRP1炎性体组分的表达变化。
　　 4.采用免疫组化的方法检测NLRP3、ASC、IL-1β在LN肾组织及正常肾组织中的表达情况。
　　 结果:
　　 1.NLRP3、NLRP1炎性体组分的表达水平
　　 1.1SLE组与正常对照组PBMC、粒细胞中NLRP3、NLRP1炎性体组分及下游分子IL-1β的表达
　　 1.1.1半定量RT-PCR结果显示，SLE患者PBMC中NLRP3 mRNA表达水平显著低于正常对照组(0.425±0.242vs0.834±0.357)，有统计学差异，P=0.0035;NLRP1mRNA表达水平显著低于正常对照组(0.504±0.096vs1.398±0.729)，有统计学差异，P=0.0002; Caspase-1 mRNA表达水平显著低于正常对照组(0.2205±0.1164vs0.8352±0.2030)，有统计学差异，P=0.0002; ASC mRNA表达水平显著低于正常对照组(0.6874±0.3166vs1.246±0.6848)，有统计学差异，P=0.035。
　　 1.1.2实时定量RT-qPCR结果显示，SLE患者PBMC中NLRP3mRNA表达水平显著低于正常对照组(0.641±0.551vs1.320±1.023)，有统计学差异，P=0.0009;NLRP1mRNA表达水平显著低于正常对照组(0.604±0.384vs1.260±0.619)，有统计学差异，P=0.0001; Caspase-1 mRNA表达水平显著低于正常对照组(1.126±1.028vs2.598±1.777)，有统计学差异，P=0.0300; IL-1β mRNA表达水平显著低于正常对照组(1.033±0.899vs2.017±0.516)，有统计学差异，P=0.0357。
　　 1.1.3 SLE患者粒细胞中IL-1β mRNA表达水平显著低于正常对照组(1.767±1.370vs0.8019±0.6836)，有统计学差异(P=0.0408)。
　　 1.2 LN患者肾组织中NLRP3、ASC、IL-1β炎性小体的表达
　　 与正常肾组织相比，NLRP3炎性小体在LN肾组织中染色强度明显降低，且着色强度与肾脏病理类型有关，其中Ⅱ型狼疮肾炎肾组织NLRP3着色最深，Ⅲ型着色次之，Ⅳ型着色最浅。ASC、IL-1β炎性小体在狼疮肾组织中表达，其中在Ⅱ型肾组织中表达最多，在Ⅲ型和Ⅳ型狼疮肾组织中表达较Ⅱ型降低。
　　 2.NLRP3、NLRP1炎性体组分间的关联分析
　　 结果显示SLE患者PBMC中NLRP3mRNA表达水平与Caspase-1呈正相关(r=0.7405，P＜0.0001)，与IL-1β mRNA呈正相关(r=0.6085，P=0.0053)，与NLRP1mRNA呈正相关(r=0.7055，P＜0.0001); NLRP1mRNA表达水平与Caspase-1呈正相关(r=0.8010，P＜0.0001)，与IL-1β mRNA呈正相关(r=0.4745，P=0.0053); Caspase-1mRNA表达水平与IL-1β mRNA呈正相关(r=0.5175，P=0.0010)。
　　 3.SLE患者NLRP3、NLRP1炎性体组分mRNA的表达水平与反映疾病活动临床指标间的相关性分析
　　 3.1与SLEDAI的相关性分析
　　 SLE患者PBMC中NLRP3mRNA表达水平与SLEDAI呈负相关(r=-0.3959，p=0.0205);NLRP1mRNA表达水平与SLEDAI呈负相关(r=-0.4113，p:0.0174);ASC mRNA表达水平与SLEDAI呈负相关(r=-0.4860，p:0.0087);Caspase-1mRNA表达水平与SLEDAI呈负相关(r=-0.3989，p:0.0215)，IL-1β mRNA表达水平与SLEDAI无显著关联。
　　 3.2与抗ds-DNA抗体的关联分析
　　 SLE患者PBMC中NLRP3mRNA表达水平与抗ds-DNA抗体呈负相关(r=-0.5493，p=0.0011);NLRP1mRNA表达水平与抗ds-DNA抗体呈负相关(r=-0.4077，P=0.0281); Caspase-1mRNA表达水平与抗ds-DNA抗体呈负相关(r:-0.4002，P:0.0284)，ASC、IL-1β mRNA表达水平与正常对照组相比无明显差异。
　　 3.3与抗AunA抗体的相关性分析
　　 SLE患者PBMC中NLRP1mRNA表达水平与抗AunA抗体呈负相关(r=-0.3357，p=0.0486);Caspase-1mRNA表达水平与抗AunA抗体呈负相关(r=-0.3699，p=0.0372); IL-1β mRNA的表达水平与抗AunA抗体呈负相关(r=-0.3544，p=0.0465)，NLRP3、ASCmRNA表达水平与正常对照组相比无明显差异。
　　 4.糖皮质激素对SLE患者PBMC中NLRP3、NLRP1炎性体组分表达水平的影响
　　 糖皮质激素治疗后，NLRP3、NLRP1、Caspase-1、IL-1β mRNA恢复高表达水平，有统计学差异，(P=0.0237、P=0.0436、P=0.0252、P=0.0148)。
　　 结论:
　　 1.SLE患者PBMC中NLRP3、NLRP1、Caspae-1炎性小体较正常对照组呈低表达，且经泼尼松治疗后恢复高表达水平，IL-1β在SLE患者粒细胞中低表达，提示NLRP3、NLRP1炎性体组分参与SLE发病机制。
　　 2.SLE患者NLRP3、NLRP1炎性体表达水平与病情活动指标（SLEDAI、抗ds-DNA抗体、抗AnuA抗体）呈负相关，提示NLRP3、NLRP1炎性体表达水平可作为SLE病情活动程度的指标，推测可能是SLE治疗的新靶点。
　　 3.与正常肾组织相比，NLRP3炎性小体在LN肾组织中低表达，且表达水平与肾脏病理类型相关，由Ⅱ型LN到Ⅳ型LN表达水平逐渐降低，与外周血PBMC中表达趋势一致，提示NLRP3信号通路参与LN肾损害的发生。
　　 第二部分
　　 NLRP3、NLRP1炎性体信号通路在类风湿关节炎免疫机制中的作用
　　 背景:
　　 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以侵犯四肢关节为主要临床表现，以关节滑膜炎为主要特征的慢性炎症性自身免疫性疾病，其病因不明，病程及预后差异大，目前已证实RA是基因、环境多种因素共同作用的结果。固有免疫和适应性免疫均参与RA发病机制。
　　 NLRP3、NLRP1炎性体是启动固有免疫及适应性免疫的关键NOD受体，通过结合蛋白ASC结合Caspase-1前体，使其活化剪切形成有活性的Caspase-1形式，活化的Caspase-1使IL-1β前体以IL-1β形式成熟和释放，介导炎症反应发生。对NLRP3、NLRP1炎性体活化机制及其效应的研究主要集中在固有免疫细胞，在RA中的研究尚不多见。
　　 目的:
　　 本研究主要是通过探索RA患者PBMC和粒细胞中NLRP3、NLRP1炎性体的表达及其与临床指标间的相关性分析，初步探讨NLRP3、NLRP1炎性体信号通路在RA发病机制中的作用。
　　 方法:
　　 1.详细收集36例RA患者和30例正常对照者的临床资料，分离PBMC和粒细胞。
　　 2.采用RT-qPCR方法检测NLRP3、NLRP1炎性体在RA及正常对照组PBMC、粒细胞mRNA的表达水平，比较其表达差异性;分析NLRP3、NLRP1炎性体组分与抗CCP抗体、RF、ESR的相关性;并检测下游炎症因子IL-1β mRNA的表达水平。
　　 结果:
　　 1.NLRP3、NLRP1炎性体组分的表达
　　 1.1 RA患者与正常对照者PBMC中NLRP3、NLRP1炎性体组分的表达
　　 RA患者PBMC中NLRP1、Caspase-1 mRNA表达水平低于正常对照组(0.9441±0.6233vs1.414±1.023，0.8690±0.8496vs1.344±1.676)，有统计学差异，P值分别为0.0457、0.0273; NLRP3、ASC、IL-1β mRNA表达水平与正常对照组相比无显著差异。
　　 1.2RA患者与正常对照组粒细胞中NLRP3、NLRP1炎性体组分的表达
　　 RA患者粒细胞中NLRP3、Caspase-1、ASC mRNA表达水平显著低于正常对照组(0.761±0.789 vs1.627±2.110,0.611±0.411 vs1.123±0.837,0.528±0.298 vs0.887±0.742)，有统计学差异，P值分别为0.0489、0.0064、0.0249。
　　 2.RA患者PBMC中NLRP3、NLRP1炎性体组分表达水平与抗CCP抗体、RF、ESR的相关性分析
　　 RA患者PBMC中NLRP1 mRNA表达水平与抗CCP抗体呈明显负相关(r=-0.3674，P=0.0354)，与RF呈显著负相关（r=-0.4189，P=0.0332），与ESR无明显关联;IL-1β mRNA表达水平与RF呈明显负相关(r=-0.3948，P=0.0340).
　　 结论:
　　 1.NLRP1、Caspase-1炎性小体在RA患者外周血PBMC中表达下调，NLRP3、ASC、Caspase-1在RA患者粒细胞中表达下调，提示NLRP3、NLRP1炎性体可能作为保护性分子参与RA免疫机制。
　　 2.NLRP1表达水平与抗CCP抗体、RF呈负相关，提示NLRP1炎性体表达水平与RA病情严重程度相关，推测可能是RA治疗的新靶点。

目录

声明

符号说明(按字母顺序排列)

第一部分 NLRP3、NLRP1炎性体信号通路在系统性红斑狼疮免疫机制中的作用

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 NLRP3、NLRP1炎性体信号通路在类风湿关节炎免疫机制中的作用

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间主要科研成果

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