不饱和透明质酸二糖的制备和活性研究

摘要

透明质酸(hyaluronicacid，HA)，又名玻璃酸，是由D-葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰氨基葡糖(GlcNAc)双糖单位通过交替的β-1，3和β-1，4糖苷键连接而成的线性高分子酸性粘多糖。HA是构成细胞外基质(ECM)的主要成分，是皮肤、玻璃体、关节滑液和软骨组织的重要成分，具有独特的理化性质和生物学功能。研究显示，HA在维持组织完整性以及在感染、损伤、胚胎发育过程中的组织形成和重塑方面发挥重要作用。
　　 1934年美国科学家Meyer和Palmer首先从牛眼玻璃体中分离得到HA，随着人们对HA结构、性质和生理功能研究的不断深入，其在医药、化妆品、食品等领域的应用越来越广泛。研究表明，不同相对分子质量(Mr)的HA具有不同甚至截然相反的活性。近年来，国内外研究者对HA降解及其降解产物的研究不断增多。透明质酸寡糖(oligosaccharidesofhyaluronan，简称o-HA)为Mr小于10000Da、单糖残基数量在2～40之间的HA分子片段，因其在促进伤口愈合、促血管生成、免疫调节以及抗肿瘤等方面具有十分重要的作用日益受到研究者的重视。o-HA的制备方法主要包括化学降解、酶降解以及生物合成法。其中，酶解制备因反应条件温和、降解效率高等特点比较适用于o-HA的制备。
　　 本课题重点研究了不饱和透明质酸二糖(unsaturatedhyaluronandisaccharide，△DiHA)的制备纯化、结构确证、细胞毒性及相关生物活性。
　　 1、△DiHA的制备
　　 研究了用一种来源于芽孢杆菌的透明质酸裂解酶(hyaluronatelyase)制备△DiHA的方法，并根据此种酶降解的特点探讨△DiHA的纯化方法。然后，通过对△DiHA样品紫外光谱、质谱、核磁共振氢谱和碳谱的分析确定了△DiHA端基异构体的结构，随后讨论了硫酸咔唑法和HPLC法测定△DiHA含量的方法。
　　 2、△DiHA的细胞毒性
　　 使用小鼠成纤维细胞(L929)评价了△DiHA的细胞毒性。结果显示，△DiHA孵育后的L929细胞的增殖速率及细胞形态较阴性对照均没有明显变化，即△DiHA对L929细胞没有细胞毒性。
　　 3、△DiHA对人脐静脉血管内皮细胞及人角膜上皮细胞增殖的影响
　　 采用MTT法测定了△DiHA对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)及人角膜上皮细胞(HCEC)增殖的影响，并使用流式细胞术检测了△DiHA对HCEC细胞周期及凋亡的影响。结果显示，△DiHA具有较强的促进HUVEC增殖的活性，并可明显促进HCEC的增殖，但对HCEC细胞周期及凋亡没有显著影响。
　　 4、△DiHA抗氧化活性研究
　　 研究了不同浓度H2O2刺激HCEC对细胞内活性氧(ROS)水平的影响以及△DiHA是否能够抑制细胞内ROS水平的升高。结果表明，在一定浓度范围内，细胞内ROS水平随培养基中H2O2浓度的升高升高，而在培养基中加入不同浓度△DiHA可一定程度降低由H2O2刺激引起的细胞内ROS水平的升高。
　　 本课题主要研究了酶解法制备△DiHA的方法，评价了△DiHA的细胞毒性、抗氧化活性及其对HUVEC和HCEC细胞增殖的影响，为△DiHA的开发应用提供了一定参考。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1 透明质酸概述

1．1 HA的结构、性质

1．2 HA的功能及应用

2 不饱和透明质酸寡糖的研究概况

2．1 透明质酸酶概述

2．2 UHAO的研究现状

3 立题依据和研究内容

3．1 立题依据

3．2 研究内容

第二章 不饱和透明质酸二糖的制备

1 材料

1．1 试剂

1．2 仪器

2 方法

2．1 不饱和透明质酸二糖的酶解制备

2．2 不饱和LMWHA及UHAO对照样品的制备

2．3 样品分析

2．4 结构确证

2．5 ΔDiHA含量测定方法比较

3 结果

3．1 样品分子量、分布指数及干燥失重

3．2 ΔDiHA的HPLC分析

3．3 ΔDiHA波谱分析

3．4 ΔDiHA含量测定

4 本章小结

第二章 ΔDiHA的细胞毒性评价

1 材料

1．1 试剂

1．2 细胞培养相关试剂的配制方法

1．3 仪器

2 方法

2．1 细胞毒性试验

3 结果

3．1 细胞毒性

4 本章小结

第四章 ΔDiHA对人脐静脉内皮细胞及角膜上皮细胞增殖的影响研究

1 材料

1．1 试剂

1．2 细胞培养相关试剂的配制方法

1．3 仪器

2 方法

2．1 ΔDiHA对HUVEC增殖的影响

2．2 ΔDiHA对HCEC增殖影响

2．3 ΔDiHA对HCEC细胞凋亡的影响

2．4 ΔDiHA对HCEC细胞周期的影响

3 结果

3．1 ΔDiHA对HUVEC增殖的影响

3．2 ΔDiHA对HCEC增殖影响

3．3 ΔDiHA对HCEC细胞凋亡的影响

3．4 ΔDiHA对HCEC细胞周期的影响

4 本章小结

第五章 ΔDiHA抗氧化活性

1 材料

1．1 试剂和耗材

1．2 仪器

2 方法

2．1 不同浓度H2O2对HCEC细胞内活性氧水平的影响

2．2 ΔDiHA的抗氧化活性

3 结果

3．1 不同浓度H2O2对HCEC细胞内活性氧水平的影响

3．2 ΔDiHA的抗氧化活性

4 本章小结

总结与展望

1 本论文取得的研究成果

2 展望

附图

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表论文