脉冲染料激光处理后的人脐静脉内皮细胞株VEGF的mRNA表达、凋亡情况以及透射电镜观察

摘要

目的:
　　 皮肤血管瘤是由血管发育异常形成的，是临床上婴幼儿最常见的良性肿瘤，以内皮细胞过度增殖为特征，常见于婴幼儿，有一定的自愈率。目前已发现多种促血管生成因子和抑血管生成因子在血管瘤的发生、发展及消退中发挥重要作用，多数学者认为VEGF是血管瘤形成的直接促进因素，它的持续高表达与否是决定血管形成的主要因素。
　　 目前针对浅表性血管瘤的应用最广泛、疗效较为确切的治疗方法为激光疗法。临床中应用最多的激光类型为波长为585nm-595nm的脉冲染料激光。该型号激光的靶色基是增生血管血液中红细胞的氧合血红蛋白，氧合血红蛋白吸收光能并转化为热能，实现对血红蛋白的热凝固作用导致血管闭塞，同时热量传导至周围的血管壁，造成血管的损伤。使血管缺血缺氧促进血管瘤进入凋亡期。
　　 血管瘤血管内皮细胞的体外培养是研究血管形成的重要手段和步骤，因人脐静脉内皮细胞系具有增殖力强的特点，故可以应用于血管瘤的体外实验的研究。
　　 既然激光在血管瘤的治疗中起到了重要的作用，那么其作用的可能机制是什么？通过激光处理人脐静脉内皮细胞能够达到什么样的效果呢？能否通过这个方案来研究脉冲染料激光治疗血管瘤的机制？本文通过使用脉冲染料激光处理人脐静脉内皮细胞，研究激光干预后细胞的生长及凋亡情况，并探讨其对细胞mRNA表达的影响。
　　 方法:
　　 使用波长为585nm的脉冲燃料激光对体外培养的人脐静脉内皮细胞株进行干预，在血管瘤常规治疗激光能量密度范围内刺激细胞，并用流式细胞技术观察细胞的凋亡情况，通过透射电镜观察细胞的超微结构变化，运用Realtime-PCR技术，检测激光干预后血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。
　　 结果
　　 1.人脐静脉内皮细胞株的培养及形态观察
　　 经过体外培养后的人脐静脉内皮细胞在形态上与正常皮肤血管内皮细胞无明显差异，可稳定传代，可作为本实验理想的实验对象。
　　 2.激光治疗血管瘤的过程中VEGF mRNA的表达
　　 RT-PCR显示，在常规治疗激光能量密度范围内处理过的人脐静脉内皮细胞与未经处理的人脐静脉内皮细胞相比，VEGF mRNA的表达均有所下降，而且下降程度随着能量密度的增强而有不同程度的增加。
　　 3.流式细胞技术检测激光处理后人脐静脉内皮细胞株的凋亡情况
　　 常规治疗能量密度4J/cm2-8J/cm2范围内，染料激光促进内皮细胞凋亡。
　　 4.激光处理后内皮细胞株的电镜观察
　　 被脉冲燃料激光处理后的内皮细胞不同程度地失去正常的形态，细胞核、细胞器、细胞膜等出现不同程度的损伤，这表明细胞不同程度的处于变性和坏死阶段。
　　 结论及意义
　　 本实验通过利用脉冲染料激光干预体外培养的人脐静脉内皮细胞，利用分子生物学技术、细胞生物学技术，对激光干预后的细胞进行研究,得出以下结论:
　　 1.染料激光干预细胞后，抑制细胞VEGF mRNA的表达
　　 2.染料激光干预能够促进人脐静脉内皮细胞凋亡
　　 3.染料激光干预对细胞的超微结构有负性影响
　　 4.染料激光可以通过对内皮细胞和VEGF mRNA的影响而达到治疗血管瘤的目的

目录

声明

摘要

符号说明

前言

实验一 人脐静脉内皮细胞株的培养、形态观察和处理

一、材料与设备

二 实验方法及步骤

实验二 脉冲染料激光对人脐静脉内皮细胞VEGF的mRNA表达的影响

一、材料与设备

二、实验方法

三、实验结果

实验三 流式细胞技术检测激光处理后脐静脉内皮细胞株的凋亡情况

一、相关试剂

二、相关器械及耗材

三、操作步骤

四、实验结果

实验四 激光处理后的人脐静脉内皮细胞株的透射电镜观察

一、实验材料

二、实验步骤

三、实验结果

讨论

结论

综述

参考文献

致谢