CD40siRNA对自身免疫性心肌炎大鼠Th17细胞及IL-17与IL-23的作用

摘要

目的：病毒性心肌炎是儿童的常见疾病之一，可导致心律失常、扩张型心肌病、心力衰竭、心源性休克甚至猝死等严重后果。其发病机制尚不明确，但越来越多的研究资料证明自身免疫性损伤是造成病毒性心肌炎后期心肌损害的重要原因。因此建立自身免疫性心肌炎的动物模型，模拟病毒性心肌炎后期免疫性损伤的发病过程，是研究病毒性心肌炎的自身免疫损伤过程、探讨病毒性心肌炎发病机制的较好的方法。Th17细胞是近年来新发现的CD4+T细胞的一个亚群，其分化的特异性转录因子是维甲酸相关孤儿受体。Th17细胞以主要分泌细胞因子IL-17为特点，参与了许多自身免疫性疾病的发病过程，比如系统性红斑狼疮、多发性硬化、病毒性肝炎的后期等。有研究发现，在病毒性心肌炎和自身免疫性心肌炎中Th17细胞亚群及外周血IL-17、IL-23浓度有明显变化，表明Th17细胞及其细胞因子IL-17、IL-23在病毒性心肌炎及免疫性心肌炎炎性反应及免疫损伤中发挥了重要作用。小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)也被称为短干扰RNA(short interfering RNA)或沉默RNA(silencing RNA)，一般含有20-25个核苷酸，主要参与RNA干扰现象，专一性的调节基因的表达。使用小干扰RNA（siRNA）特异性的敲除分子靶点是一种新兴的基因沉默的方法。因此使用小干扰RNA治疗自身免疫性疾病也许是一种极有前景的治疗方法。目前小干扰RNA的干扰效果已经在越来越多的细胞实验中被验证，但是，关于小干扰RNA在动物实验中的干扰效果的研究还比较少见，使用小干扰RNA治疗大鼠自身免疫性心肌炎尚未有人研究报道。本研究第一次应用CD40小干扰RNA(CD40siRNA)慢病毒表达载体对猪心肌球蛋白免疫诱导的实验性自身免疫性心肌炎(experimental autoimmune myocarditis，EAM)大鼠进行免疫治疗，并观察CD40siRNA慢病毒表达载体对EAM大鼠心肌组织病理积分、心肌组织RORCmRNA表达水平、外周血中IL-17及IL-23浓度的影响，分析其潜在的作用机制，以便帮助医务工作者找到更有效的治疗病毒性心肌炎的方法。
　　 方法：选取40只6-8周龄健康雄性Lewis大鼠，大鼠均为无特殊病原体的SPF级实验动物，体质量在185-210g之间，平均体质量为197.25±5.82g。40只大鼠被随机分为EAM模型组、正常对照组、CD40siRNA治疗组及siRNA对照组四组，每组10只大鼠。EAM模型组、CD40siRNA治疗组及siRNA对照组大鼠以猪心肌球蛋白与完全弗氏佐剂的混合液0.2ml于大鼠双后足足垫区皮下注射，正常对照组大鼠仅在双后足足垫区皮下注射PBS缓冲液0.2ml/只。CD40siRNA治疗组大鼠与siRNA对照组大鼠于免疫后第8天分别尾静脉注射CD40siRNA慢病毒表达载体、siRNA慢病毒表达载体。免疫后第21天处死全部大鼠，光镜下观察大鼠心肌组织病理变化并计算心肌组织病理积分;实时定量PCR法(RQ-PCR)检测心肌组织Th17细胞分化的特异性转录因子RORCmRNA表达水平;酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠外周血中细胞因子IL-17与IL-23浓度。
　　 结果：
　　 1.CD40siRNA治疗组心肌组织病理积分比EAM模型组心肌组织病理积分明显下降(2.34±0.60 vs.3.40±0.35，p＜0.05)，siRNA对照组心肌组织病理积分与EAM模型组心肌组织病理积分相比无差异(3.56±0.21 vs.3.40±0.35，p＞0.05);
　　 2.CD40siRNA治疗组心肌组织RORC mRNA表达比EAM模型组心肌组织RORC mRNA表达明显下降(2.13±0.28 vs.2.93±0.36，p＜0.05)，siRNA对照组心肌组织RORC mRNA与EAM模型组心肌组织RORC mRNA相比无差异(3.05±0.16 vs.2.93±0.36,p＞0.05);
　　 3.CD40siRNA治疗组外周血IL-17浓度较EAM模型组外周血IL-17浓度明显下降(114.38±8.29 vs.148.70±5.04，p＜0.05)，siRNA对照组外周血IL-17浓度与EAM模型组外周血IL-17浓度相比无差异(144.15±5.82 vs.148.70±5.04，p＞0.05);
　　 4.CD40siRNA治疗组外周血IL-23浓度较EAM模型组外周血IL-23浓度明显下降(107.00±7.69 vs.136.98±23.16，p＜0.05)，siRNA对照组外周血IL-23浓度与EAM模型组外周血IL-23浓度相比差异无统计学意义(142.11±15.87 vs.136.98±23.16, p＞0.05)。
　　 结论：
　　 1.CD40siRNA可减轻实验性自身免疫性心肌炎大鼠的心肌炎症反应。
　　 2.CD40siRNA可以下调实验性自身免疫性心肌炎大鼠RORC mRNA的表达，减少外周血IL-17及IL-23的分泌水平，具体机制可能与其干扰共刺激分子CD40的生成，阻断CD40-CD40L共刺激信号通路有关。

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