汉族人群冠状动脉粥样硬化性心脏病8和11号染色体易感基因位点扫描研究

摘要

目的：
　　 冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronaryarterydisease，CAD)是导致发达国家和发展中国家死亡和致残的重要原因之一，亦被人们公认为是一种复杂的多因素紊乱疾病，包括环境和遗传因素。许多环境危险因素已经被国内外研究所明确，但冠心病分子遗传学机制还尚不清楚。冠心病遗传易感基因概念得到国内外研究人员的重视，从基因水平去研究冠心病发病机制，从而为冠心病高危人群早期筛查和危险因素预防提供依据成为近年来研究热点。冠心病的全基因组扫描研究在世界各大研究中心相继展开，目前国内对冠心病的遗传学研究主要涉及冠心病的候选基因的研究，在汉族人群中关于冠心病的易感基因扫描研究甚少。本研究选取156例冠心病患者和1000例正常对照者分别建立病例组DNA混合池(DNApooling)和对照组DNA混合池，经微卫星遗传标记、聚合酶链反应和电泳等基因扫描技术，确定汉族人群中8号和11号染色体上具有统计学意义的易感基因位点，为今后精确定位冠心病易感基因突变位点或多态性位点打下基础。
　　 方法：
　　 1.从山东大学齐鲁医院收集冠心病患者156例作为病例组样本。对照组是来自山东省血液中心的健康献血者1000例。病例组和对照组均来自山东地区汉族人群，且符合个体与个体之间无血缘关系。
　　 2.取EDTA抗凝的患者与对照者外周静脉血5mL，采用改进的酚-氯仿法逐个提取基因组DNA。DNA浓度的测定是用BECKMANDU530紫外分光光度计，且每个样本DNA浓度测量需2次以上，当两次测量误差小于10％时的两个数值方可用于计算平均值，所得平均值作为其原液浓度。最后将每份DNA样品均稀释至浓度为20ng/μL。再取每个患者DNA样品10μL充分混匀，构建一个冠心病患者混合池，同理构建一个正常对照者DNA混合池。
　　 3.以间隔10cM（厘摩）遗传距离为标准选择8号染色体上13个微卫星遗传标记位点，和11号染色体上18个微卫星遗传标记位点。
　　 4.在GeneAmpPCRSystem9700扩增仪上，分别以病例组DNA混合池和对照组DNA混合池中的DNA样本做为模板进行DNA片段扩增。然后在ABIAvant-3100毛细管遗传分析仪上进行电泳。
　　 5.经上述分型后每个微卫星遗传位点都得到等位基因峰图，运用ABIGene.Mapper软件对各位点等位基因峰图进行分析时，首先计算每个等位基因数目占所有等位基因数目的比率和每个位点的等位基因具体数目等，再运用CLUMP软件分析两组间等位基因频率差异，应用x2检验，以P＜0.05作为统计学标准，确定有意义的遗传易感位点。
　　 结果：
　　 8号和11号染色体基因扫描结果:经过多次反复实验，最终获得了8号染色体上13个微卫星遗传位点和11号染色体上18个遗传位点的全部分型结果，得到D8S264位点(8p23.3-p23.2)、D8S285位点(8q12.1)和D11S1338(11p15.4)3个位点的等位基因图谱。通过CLUMP统计软件分析比较病例组DNA混合池和对照组DNA混合池间的等位基因频率分布差异。发现8号染色体上的D8S264位点(8p23.3-p23.2)x2=17.114183,P=0.020000、D8S285位点(8q12.1)x2=13.018997,P=0.030000和D11S1338(11p15.4)位点x2=18.514360,P=0.010000差异有统计学意义(P＜0.05)。经过多重PCR与电泳的重复实验，最终证实了这三个遗传位点的阳性结果，提示这三个位点与冠心病呈现相关，在其附近可能存在冠心病的易感基因位点突变或多态性改变。
　　 结论：
　　 在山东地区汉族人群冠心病患者中，D8S264位点(8p23.3-p23.2)、D8S285位点(8q12.1)和D11S1338位点(11p15.4)与冠心病呈现相关，在其附近可能存在冠心病的易感基因。还需在更大样本中对于这一步得到的阳性结果进行个体基因分型，精确定位汉族人群中在8号和11号染色体上冠心病易感基因位点突变或基因多态性的改变。
　　 意义：
　　 目前全基因组关联研究推崇两阶段研究设计策略，第一阶段用DNA混合池的方法初步筛选出与冠心病相关的易感基因位点，第二阶段就可以在更大的样本中对于前一阶段所得的阳性结果重复验证，并对验证仍为阳性位点进行个体基因分型研究，这两阶段结合分析CAD易感基因位点是一种既经济又有较高把握度的研究策略。本研究通过基因扫描关联分析的方法对8号染色体上13个遗传位点和11号染色体上18个微卫星遗传标记位点进行了初步筛选，发现了在8号和11号染色体上三个与冠心病关联的遗传位点。为下一步在更大样本中对于这一步得到的阳性结果进行个体基因分型奠定了基础，从而为从基因水平研究冠心病发病机制，冠心病高危人群早期筛查和危险因素预防提供依据。我们运用的DNA混合池技术大大减少了基因扫描的成本和工作量，提高了效率，不失为冠心病的分子遗传研究的好方法。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

资料与方法

结果

讨论

结论

展望

附录

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间发表的学术论文