RNAi阻断Act1的表达对IL-17刺激SW982细胞分泌IL-6和IL-8影响的研究

摘要

研究背景:
　　 类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是以对称性多关节炎为主要临床表现的系统性自身免疫病，其患病人数约占全世界总人口的1.0％，在我国的发病率高达0.32％-0.36％，致残率达15％，是一种严重影响人民生活质量和生命健康的重大自身免疫病。同其它自身免疫疾病一样，类风湿关节炎的致病原因和发病机制尚不清楚，目前仍无十分有效的针对性治疗。研究发现RA关节软骨和骨的损伤主要是由于滑膜细胞的过度活化和增生引起。滑膜成纤维样细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)是滑膜组织最活跃的组成细胞，能够通过自分泌或旁分泌的方式产生大量的炎性细胞因子及免疫反应介质，与RA滑膜的持续性慢性炎症、关节破坏和滑膜增生有密切的关系。研究表明，在RA患者滑膜液中存在多种细胞因子，如IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、TGF-β、TNF-α、GM-CSF等。
　　 核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是参与炎症细胞因子表达的主要转录因子之一，其调节炎症反应、促进滑膜细胞增生、参与关节结构重建，在RA发病机制中起关键的调控作用。以NF-κB为靶点，针对其信号通路中的各个环节抑制其活化，日前已成为抗炎、抗风湿治疗研究的热点。但基础的NF-κB是机体生长发育所必须的，因此，找出NF-κB激活途径的抑制物而不影响其生理活性，将是今后RA治疗研究中的一个重要方向。
　　 2000年Li等首次从HEK(human embryonic kidney)细胞系293中分离出一种60-kD的的蛋白质，它能够结合并且活化IκB激酶(IKK)，导致NF-κB的活化，称之为Act1(NF-κB activator1)。与此同时，另外一个研究小组AntonioLeonardi等，应用酵母双杂交技术在转染的人上皮细胞和T细胞中分离出CIKS（connection to IKK and SAPK/JNK），一种能够与NEMO/IKKγ相互作用的蛋白，它能够激活IKK和应激活化蛋白激酶(SAPK又称为JNK)信号复合体。CIKS刺激IKK、p38和JNK，并能够反式激活NF-κB依赖的指针，因此连接上游信号事件于IKK、SAPK和JNK。后来，CIKS和Act1被证明是同一种蛋白。Act1的过表达能够活化NF-κB和JNK(Jun kinnase)途径。因为Act1能够活化NF-κB，为此，似乎并不希望Act1表达于正常的人体组织和器官。抑制Act1的表达，可能抑制NF-κB的炎症激活途径而不影响其生理活性，成为治疗RA新的靶点。
　　 Novatchkova等发现，像IL-17R一样，Act1含有SEFIR(similar expressionto fibroblast growth factor genes and IL-17Rs)和TRAF6(tumor necrosis factorreceptor associated factor6)结合区域，这使得Chang等做出Act1是IL-17RA(IL-17 receptor A)的接头蛋白这一假设，并进行了实验证明。当应用Act1特异的shRNA阻断Act1在MEFs细胞中的表达时，IL-17刺激后所产生的IL-6与对照组细胞相比显著降低。Act1缺失的细胞由IL-17刺激所引起的IκBα的降解被取消。Chang等的研究表明Act1是IL-17R激活与NF-κB活化之间的枢纽。
　　 IL-17具有很强的致炎性，是一种激活破骨细胞和引起软骨基质破坏的因子。多项研究已经证明IL-17在RA的发病过程中起了重要的作用。IL-17在RA患者关节滑膜及滑膜液中大量表达。在多种类型关节炎，滑膜及关节软骨均有IL-17R表达，在RA的滑膜组织中，IL-17R(+)血管所占百分比最高。IL-17能诱导活化T细胞，促进滑膜细胞分泌多种细胞因子，抑制软骨细胞合成基质，增强破骨细胞活性，最终导致骨侵蚀，并且能与其他细胞因子相互作用，导致RA一步发展。
　　 由此可见，Act1可能通过激活FLS中的NF-κB在RA的发病机制中发挥一定的作用，在致炎因子的刺激下，Act1过表达激活NF-κB，引起各种细胞因子的表达增多和凋亡的减少，但目前尚未见文献报道。
　　 研究目的:
　　 本实验在于研究Act1在FLS细胞中基因及蛋白质的表达水平并观察经IL-17刺激后的变化，在此基础上运用RNA干扰技术抑制编码Act1的基因Traf3ip2在FLS细胞中的正常表达，观察Act1基因表达下降后IL-17诱导的IL-6和IL-8表达的变化。验证Act1基因异常表达是否参与了RA的发病，为下一步的相关研究提供基础理论支持，并为RA的治疗提供新的方向。
　　 方法:
　　 1.培养人滑膜成纤维样细胞至对数生长期备用。
　　 2.应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白免疫印迹(Western Blot)方法来检测SW982细胞中Act1 mRNA和蛋白质的表达情况。
　　 3.根据GeneBank中Act1（Traf3ip2）的基因序列，设计并合成4条特异性Traf3ip2 siRNA的预混试剂;1条非特异性阴性对照siRNA试剂(DY-547荧光标记)。
　　 4.SW982细胞常规体外培养至对数生长期，并设为三组:实验组(转染Traf3ip2siRNAs)、阴性对照组(转染阴性对照siRNA)与空白对照组（除不含siRNA外，其余试剂与另外两组相同），分别进行瞬时转染。
　　 5.将DY-547标记的阴性对照siRNA转染入SW982细胞，使用流式细胞术(FCM)测定转染效率，根据结果筛选出转染效率最佳优化条件进行后续实验。
　　 6.应用RT-PCR和Western Blot方法分别检测三组细胞转染后Act1(Traf3ip2)基因mRNA和蛋白的表达，评价干扰效果。
　　 7.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法检测细胞上清中IL-6和IL-8的浓度。
　　 8.统计学方法:应用SPSS11.0软件包进行统计分析，以均数±标准差（(x-)±s）表示定量资料数据，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05有统计学意义。
　　 结果:
　　 1.Act1在人滑膜成纤维细胞中在基因水平及蛋白水平呈阳性表达。
　　 2.RT-PCR结果显示经IL-17刺激后Act1 mRNA的表达水平增高，其增高程度与IL-17的刺激浓度及刺激时间呈正相关。
　　 3.采用Westem Blot方法检测三组SW982细胞株中Act1蛋白的表达水平，与空白对照组相比，转染特异性siRNA组Act1蛋白的表达明显下降，而阴性对照组的表达量无显著性差异。
　　 4.siRNA转染效果:荧光标记的siRNA通过DharmaFECTTM1转染入SW982细胞株，转染近48h，时荧光显微镜下粗略观察转染效果并经流式细胞仪分析转染效率。siRNA和DharmaFECTTM1以终浓度100nmol/l∶2.0μl的比例混合时转染效率最高，以相同条件进行后续研究。
　　 5.ELISA检测培养上清中细胞因子IL-6，IL-8的表达，观察特异性Traf3ip2siRNA转染SW982细胞株后IL-17诱导的IL-6，IL-8的表达量降低。
　　 结论:
　　 1.胞质衔接蛋白Act1存在于人滑膜细胞中。
　　 2.经IL-17刺激后，Act1在SW982细胞系中的表达增加，并且其表达水平与刺激浓度以及刺激时间成正相关。
　　 3.RNAi干扰可以有效地抑制Act1基因mRNA和Act1蛋白表达。
　　 4.应用RNA干扰技术将编码Act1的基因Traf3ip2沉默掉后，IL-17诱导的IL-6和IL-8的表达减少，这说明在SW982细胞系中IL-17可通过Act1通路诱导IL-6和IL-8的产生。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

综述

致谢

攻读博士学位期间所发表的学术论文

英文文章