人多发性骨髓瘤耐药细胞株KM3/BTZ的建立及和厚朴酚逆转其耐药性的研究

摘要

背景:多发性骨髓瘤(Multiplemyeloma，MM)是一种以骨髓中单克隆浆细胞大量增生为特征的恶性疾病，发病率约占造血系统肿瘤的10％。随着蛋白酶体抑制剂的出现、支持治疗的加强以及造血干细胞移植技术的应用，多发性骨髓瘤的治疗效果已取得了明显的改善。但由于耐药的发生，大多数患者最终进入了难治复发阶段，多发性骨髓瘤仍不可治愈。和厚朴酚(Honokiol，HNK)是由木兰科植物厚朴提纯的化合物，在血液系统肿瘤（如多发性骨髓瘤、急性白血病）和实体肿瘤（如黑色素瘤、乳腺癌）可以发挥抑制增殖作用。近年米研究表明和厚朴酚联合化疗药物对耐药细胞也具有抗肿瘤效应，在逆转耐药方面具有潜在的应用前景。
　　 目的:以多发性骨髓瘤KM3细胞株为研究对象，建立人多发性骨髓瘤硼替佐米耐药细胞株KM3/BTZ，初步探讨多发性骨髓瘤的耐药机制。选择和厚朴酚作为逆转剂，观察和厚朴酚对KM3/BTZ细胞耐药性的逆转作用。
　　 方法:1.采用浓度梯度递增法，以人多发性骨髓瘤KM3细胞株为亲本，建立耐硼替佐米的多发性骨髓瘤细胞株KM3/BTZ。
　　 2.应用倒置显微镜观察KM3和KM3/BTZ细胞生物学特征的变化，绘制生长曲线，并计算群体倍增时间。
　　 3.采用MTT法检测不同浓度的硼替佐米对KM3细胞及KM3/BTZ细胞的增殖抑制效应，鉴定耐药细胞株的耐药性，计算耐药倍数。
　　 4.采用RT-PCR方法检测MDR-1在亲代和耐药细胞株中的表达情况。
　　 5.采用MTT法检测不同浓度和厚朴酚对KM3和KM3/BTZ细胞的细胞毒作用，确定和厚朴酚对KM3/BTZ细胞的的低毒性药物浓度(细胞增殖抑制率＜20％)。
　　 6.采用MTT法测定低细胞毒性浓度的和厚朴酚联合不同浓度的硼替佐米对KM3/BTZ细胞增殖的影响，计算逆转耐药倍数。
　　 7.采用流式细胞术检测低细胞毒性浓度的和厚朴酚联合不同浓度硼替佐米作用于KM3/BTZ细胞，各组细胞的凋亡情况。
　　 结果:1.成功建立了耐硼替佐米的多发性骨髓瘤细胞株KM3/BTZ，耐药性稳定。
　　 2.KM3细胞的群体倍增时间为（27.33±1.61）h，而KM3/BTZ细胞的群体倍增时间为（38.26±1.22）h。与亲代KM3细胞相比，耐药细胞KM3/BTZ的倍增时间显著延长（P＜0.05），生长增殖缓慢。
　　 3.MTT结果显示硼替佐米对KM3和KM3/BTZ细胞的IC50值分别为（17.82±1.03）ng/mL和（351.26±3.51）ng/mL，耐药倍数为19.7倍（P＜0.05）。
　　 4.RT-PCR结果显示亲代和耐药细胞内末见MDR-1mRNA的表达。
　　 5.MTT结果显示和厚朴酚对KM3和KM3/BTZ细胞的IC50值分别为（5.97±1.56）μg/mL和（7.82±1.05）μg/mL，4μg/mL的和厚朴酚对KM3/BTZ细胞的增殖抑制率小于20％，可以作为逆转实验的药物浓度。
　　 6.MTT结果显示4μg/mL和厚朴酚联合不同浓度硼替佐米作用于KM3/BTZ细胞，IC50从单用硼替佐米的（351.26±3.51）ng/mL降至（168.3±3.77）ng/ml，逆转倍数为2.08倍(P＜0.05)。
　　 7.流式细胞术结果表明和厚朴酚联合硼替佐米可以显著提高KM3/BTZ细胞株的凋亡率（P＜0.05）。
　　 结论:成功建立人多发性骨髓瘤耐药细胞株KM3/BTZ，耐药性稳定，为研究耐药机制及逆转耐药提供理想的模型。MDR-1未参与KM3/BTZ细胞对硼替佐米的耐药过程。和厚朴酚能够部分恢复耐药细胞株对硼替佐米的敏感性，具体机制仍需进一步研究。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 人多发性骨髓瘤耐药细胞株KM3/BTZ的建立及耐药机制的初步探讨

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附表

附图

参考文献

第二部分 和厚朴酚逆转多发性骨髓瘤KM3/BTZ细胞对硼替佐米耐药性的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附表

附图

参考文献

致谢

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