人miR-147a真核表达载体的构建及对肺癌细胞增殖、侵袭的影响

摘要

miRNA(microRNA)是真核细胞重要的转录后调控因子，在细胞及生物的增殖凋亡、发育分化等过程中发挥重要作用，其功能异常可以导致多种病理状态，包括肿瘤的发生和转移。很多肿瘤中均发现了特异性的表达异常的miRNAs。目前认为，许多miRNAs在肿瘤发生过程中，或者作为抑癌基因下调原癌基因的活性，或者作为癌基因下调抑癌基因的活性，或者作为肿瘤转移调节因子发挥作用，其自身突变、缺失、易位及相互调控异常等还可导致相关基因异常表达，因此miRNA在人类肿瘤的发生发展中发挥重要的调控作用，并可作为肿瘤诊断的新型分子标记物。miRNA在肺组织的发育中起重要作用，其异常表达与肺癌的进展过程具有密切的关系，因此筛选、鉴定肺癌特异的miRNA并阐明其在肺癌发生发展过程中的分子机制对于肺癌的诊断、预后和靶向治疗有相当大的应用价值。我们在前期工作中，利用miRNA芯片分析9-顺维甲酸对肺癌细胞株A549miRNA表达谱的影响，发现9-顺维甲酸可上调miR-147a两倍以上，并经实时荧光定量PCR证实，由此推测miR-147a可能具有肿瘤抑制作用。据此，我们构建了miR-147a的表达载体pSilencer-147a，并对其在肺癌细胞A549中的表达和功能进行初步研究。
　　 目的:
　　 构建人miR-147a真核表达载体，检测其在肺腺癌细胞A549中的表达以及对A549细胞增殖能力、侵袭能力的影响。
　　 方法:
　　 1.重组质粒载体pSilencer-147a的构建:以A549细胞总RNA为模板，RT-PCR扩增miR-147a的前体序列(pri-mir-147a)，插入表达载体pSilencer-CMV neo，构建pSilencer-147a重组载体。
　　 2.qRT-PCR直接检测外源性miR-147a的表达:A549细胞接种到25ml培养瓶中，使用X-tremeGENE HP转染试剂，将pSilencer-147a转染A549细胞，pSilencer空载体作对照。48h后收集细胞提取RNA，qRT-PCR检测外源性miR-147a的表达。
　　 3.重组质粒载体pMIR-147aT的构建:人工合成miR-147a的靶序列147aT，插入载体pMIR-REPORTTM Luciferase，构建pMIR-147aT重组质粒。
　　 4.报告基因分析间接检测miR-147a的表达:将A549细胞接种到24孔板中，以pSilencer-147a和pMIR-147aT转染A549细胞，对照组分别为:
　　 ①转染等量的pSilencer147a和pMIR-REPORT;
　　 ②转染等量的pSilencer和pMIR-147aT;
　　 ③转染等量的pSilencer和pMIR-REPORT。
　　 48h后收集细胞，裂解后检测它们的相对荧光素酶活性。
　　 5.MTT分析检测外源性miR-147a过表达对A549细胞增殖能力的影响:将A549细胞分别进行:
　　 ①不做任何处理;
　　 ②只用X-tremeGENE HP转染试剂处理;
　　 ③以X-tremeGENE HP转染pSilencer质粒;
　　 ④以X-tremeGENE HP转染pSilencer-147a质粒。
　　 然后将处理后的细胞接种到96孔板中继续培养24～96h，MTT法检测其转然后对细胞增殖能力的影响。
　　 6.Matrigel侵袭实验检测外源性miR-147a过表达对A549细胞侵袭能力的影响:A549细胞转染后，用无血清培养基将细胞接种到Transwell小室中，继续培养48h后，擦去未穿过的细胞，甲醇固定小室底部已穿过的细胞并以吉姆萨染液染色，计算侵袭效率。
　　 7.pGL4-AP1等重组质粒载体的构建:人工合成肿瘤信号应答元件AP1，ELK1，cMYC，STAT3，FOXO，TCF，插入载体pGL4.23[luc2/minP] Vector中，构建肿瘤信号应答元件-荧光素酶报告基因重组载体pGL4-AP1，pGL4-ELK1，pGL4-cMYC, pGL4-STAT3, pGL4-FOXO, pGL4-TCF。
　　 8.报告基因分析检测miR-147a对肺癌相关肿瘤信号途径的影响:转染前一天，A549细胞接种于48孔板，以X-tremeGENE HP分别将pGL4-AP1，pGL4-ELK1，pGL4-cMYC，pGL4-STAT3，pGL4-FOXO，pGL4-TCF重组载体与pSilencer-147a进行共转染，同时进行pSilencer空载体和pGL4-AP1，pGL4-ELK1，pGL4-cMYC，pGL4-STAT3，pGL4-FOXO，pGL4-TCF的共转染作为对照。转染48h后收集细胞，检测其相对荧光素酶活性。
　　 结果:
　　 1.构建的pSilencer-147a重组质粒，经限制性酶切和DNA测序证实构建成功。
　　 2.pSilencer-147a转染A549细胞后，qRT-PCR检测到明显的外源性miR-147a表达。
　　 3.构建的pMIR-147aT重组质粒，经限制性酶切和DNA测序证实构建成功。
　　 4.报告基因分析结果证实，pSilencer-147a可在A549细胞中有效表达功能性的miR-147a。
　　 5.MTT结果显示，miR-147a过表达可明显抑制A549细胞的增殖，转染48h，72h，和96h后，与对照组相比抑制效果分别达到13％，18％和30％。
　　 6.Matrigel侵袭实验结果显示，miR-147a过表达可明显抑制A549细胞的侵袭能力，转染48 h后，与pSilencer4.1阴性对照组细胞相比，实验组侵袭至Transwell小室底膜下表面的细胞数减少了72％。
　　 7.构建的pGL4-AP1,pGL4-ELK1,pGL4-cMYC,pGL4-STAT3,pGL4-FOXO,pGL4-TCF重组质粒，经限制性酶切和DNA测序证实构建成功。
　　 8.报告基因分析结果显示miR-147a过表达可显著下调pGL4-AP1（下调了50％）、pGL4-ELK1（下调了57％）、pGL4-cMYC（下调了58％）的荧光素酶活性。
　　 结论:
　　 成功构建了人miR-147a真核表达载体，并在肺腺癌细胞A549中有效表达，对A549细胞的增殖和侵袭产生抑制作用，该作用可能与miR-147a对EGFR-RAS-MAPK信号途径的抑制有关。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1 材料

1．1 主要试剂

1．2 主要培养基和缓冲溶液及其配置方法

1．3 主要仪器

2 方法

2．1 人miR-147a真核表达载体(pSilencer-147a)的构建

2．2 qRT-PCR检测外源性miR-147a的表达

2．3 人miR-147a靶序-报告基因融合载体pMIR-147aT的构建

2．4 报告基因分析间接检测miR-147a的表达

2．5 MTT分析

2．6 Matrigel侵袭实验

2．7 肿瘤信号应答元件-荧光素酶报告基因重组载体的构建

2．8 报告基因分析检测pSilencer-147a对肺癌相关肿瘤信号途径的影响

2．9 统计学处理

3 结果

3．1 pSilencer-147a重组载体的酶切鉴定及测序

3．2 miR-147a表达载体在肺癌A549细胞中的表达

3．3 pMIR-147aT重组载体的酶切鉴定及测序

3．4 报告基因分析检测miR-147a的表达

3．5 pSilencer4．1-147a对A549细胞增殖能力的影响

3．7 肿瘤信号应答元件-荧光素酶报告基因重组载体的酶切鉴定及测序

3．8 pSilencer4．1-147a转染对肿瘤信号途径的影响

讨论

参考文献

致谢

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