平行设计双氢青蒿素哌喹片人体药动学及生物等效性评价的研究

摘要

目的:1.建立高效液相色谱-质谱法进行人血浆中双氢青蒿素和哌喹浓度测定。2.平行设计双氢青蒿素哌喹片在健康志愿者体内的药动学及生物等效性研究，并评价它们的吸收、分布、代谢及排泄动力学特征。3.采用不同统计分析方法进行双氢青蒿素哌喹片等效性评价，研究末端消除相及不同药代动力学软件对其等效性评价的影响。
　　 方法:1.血样经处理后采用高效液相色谱-质谱联用仪进行测定。双氢青蒿素的质谱条件为:电喷雾电离源(ESI)，正离子模式检测;毛细管电压4000 V;干燥气温度350℃，干燥气(N2)流速12.0 L·min-1，雾化气压力45 psi;选择性监测质荷比（m/z）为221.2（双氢青蒿素）和283.2（内标青蒿素）的离子峰，碎片电压分别为80 V和70 V。其色谱条件为:选用色谱柱InertsilODS-3(4.6×150mm，5μm)，流动相为10 mmol·L-1乙酸铵（含0.1％甲酸）∶甲醇∶乙腈=37∶43∶20(V/V/V)，在线脱气;柱温:30℃，流速:0.8 mL·min-1，进样量:10μL。
　　 哌喹的质谱条件为:电喷雾电离源(ESI)，正离子模式检测;毛细管电压4000 V，干燥气温度为350℃，干燥气(N2)流速11.0 L·min-1，雾化气压力50 psi;选择性监测质荷比(m/z)为535.2（哌喹）和235.1（内标利多卡因）的离子峰，碎片电压分别为120 V和90 V。其色谱条件为:Gemini C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流动相为乙腈∶2.5 mM乙酸铵（氨水调pH值至10.5）=63∶37，在线脱气;柱温:25℃，流速:0.8 mL·min-1，进样量:5μL。
　　 2.采用单中心、随机、平行、对照试验设计。72例健康男性受试者按体重配对后随机分为两组，分别服用双氢青蒿素哌喹片试验制剂或参比制剂，于药前和药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12、24、36h和3、5、7、10、14、21、28天，肘静脉取血6 mL，肝素抗凝，6000rpm，离心5 min，分离血浆，-20℃冷冻保存待测。采用本课题建立的高效液相色谱-质谱法测定双氢青蒿素和哌喹的经时血浓度。
　　 根据所测双氢青蒿素、哌喹血浓度-时间数据，采用WinNonLin6.2.1药代动力学软件分别计算双氢青蒿素、哌喹主要药代动力学参数(t1/2，AUC0-t，AUC0-∞，CL，Vd)， Cmax和Tmax采用实测值，并根据试验制剂和参比制剂双氢青蒿素哌喹AUC0-t计算试验制剂的相对利用度。对双氢青蒿素和哌喹主要药动学参数AUC0-t和Cmax进行90％置信区间分析，评价试验制剂和参比制剂的生物等效性。
　　 3.根据0-72h所测哌喹的血浓度-时间数据，用WinNonLin6.2.1药代动力学软件计算哌喹药代动力学参数AUC0-72，Cmax和Tmax采用实测值，对哌喹药动学参数AUC0-72和Cmax进行90％置信区间分析，评价试验制剂和参比制剂的生物等效性，并比较其与AUC0-672等效性评价结果的不同。
　　 采用PKsolver3.0和WinNonLin6.2.1两种药代动力学软件对双氢青蒿素哌喹片进行人体药动学和生物等效性研究，用配对t检验对两种软件计算出的主要药动学参数(t1/2，AUC0-t，AUC0-∞，CL，Vd)进行统计分析，考察是否有统计学差异，并比较二者生物等效性评价结果的不同。
　　 结果:1.本课题建立的HPLC-MS样本测定条件下，双氢青蒿素和哌喹的基质效应、回收率分别在96％～105％、48％～62.5％和91％～109.3％、91％～108％，血浆中的基质对测定无干扰，满足测定要求。双氢青蒿素在5～500 ng·mL-1血浆浓度范围内线性良好，r2＞0.99;哌喹在5～400 ng·mL-1血浆浓度范围内线性良好，r2＞0.99。二者定量下限均为5 ng·mL-1，准确度分别为93％～107％、100％～110％，均在±20％之内，且精密度小于5％。双氢青蒿素和哌喹血浆样本稳定性试验的准确度分别在86％～113％和88％～113％之间，精密度均小于11％，表明二者稳定性良好。
　　 2.72名受试者单次口服试验制剂或参比制剂双氢青蒿素哌喹片后采用WinNonLin6.2.1药代动力学软件分析得出的双氢青蒿素主要药动学参数t1/2分别为(1.03±0.17)h和(1.11±0.28)h，Tmax分别为(1.72±0.96)h和(1.53±0.92)h，Cmax分别为(236.243±91.087) ng·mL-1和(245.184±120.789) ng·mL-1，AUC0-t分别为(561.613±189.513) ng·mL-1·h和(552.821±240.838) ng·mL-1·h，AUC0-∞分别为(574.784±190.812) ng·mL-1·h和(565.195±241.822) ng·mL-1·h，CL分别为(236.0±88.9) L·h-1和(252.4±118.2) L·h-1, Vd分别为(347.4±141.5)L和(393.3±162.4)L。以双氢青蒿素AUC0-t计算相对生物利用度F为101.6％。哌喹主要药代动力学参数t1/2分别为(289.08±171.11)h和(269.07±238.16)h，Tmax分别为(3.32±1.89)h和(3.13±0.91) h, Cmax分别为(223.815±110.931) ng·mL-1和(225.494±105.222)ng·mL-1, AUC0-t分别为(8969.881±4632.410) ng·mL-1·h和(8817.516±4232.909)ng·mL-1·h, AUC0-∞分别为(11906.837±5792.982) ng·mL-1·h和(11461.232±5755.807)ng·mL-1·h, CL分别为(103.5±58.1) L·h-1和(109.6±63.4) L·h-1, Vd分别为(35076.5±15303.4)L和(32034.7±18566.3)L。以哌喹AUC0-t计算相对生物利用度F为101.7％。
　　 双氢青蒿素AUC0-t、 Cmax比值的90％置信区间分别为89.1％～121.8％、83.6％～119.3％;哌喹AUC0-t、 Cmax比值的90％置信区间分别为82.9％～123.8％、80.7％～120.9％;均分别落在80％～125％、75％～133％区间内。
　　 3.以哌喹AUC0-72计算相对生物利用度F为98.0％。哌喹AUC0-72比值的90％置信区间为83.5％～117.5％，同样落在80％～125％区间内。
　　 72名受试者单次口服试验制剂或参比制剂双氢青蒿素哌喹片后采用PKsolver3.0药代动力学程序分析得出的双氢青蒿素主要药动学参数t1/2分别为(1.02±0.17)h和(1.11±0.27)h，Tmax分别为(1.72±0.96)h和(1.53±0.92)h，Cmax分别为(236.243±91.087) ng·mL-1和(245.184±120.789) ng·mL-1, AUC0-t分别为(575.108±194.250) ng·mL-1·h和(565.444±246.383) ng·mL-1·h, AUC0-∞分别为(588.198±195.521) ng·mL-1·h和(577.819±247.258) ng·mL-1·h，CL分别为(230.7±87.2) L·h-1和(246.9±115.5) L·h-1, Vd分别为(338.7±140.6)L和(382.4±156.8)L。以双氢青蒿素AUC0-t计算相对生物利用度F为101.7％。哌喹主要药代动力学参数t1/2分别为(288.87±171.31)h和(269.07±238.16)h，Tmax分别为(3.32±1.89)h和(3.13±0.91) h, Cmax分别为(223.815±110.931) ng·mL-1和(225.494±105.222)ng·mL-1, AUC0-t分别为(9102.841±4723.946) ng·mL-1·h和(8958.835±4306.120)ng·mL-1·h, AUC0-∞分别为(12035.729±5875.097) ng·mL-1·h和(11602.551±5814.924)ng·mL-1·h, CL分别为(102.4±57.2) L·h-1和(108.3±62.9) L·h-1,Vd分别为(34712.0±15249.5)L和(31715.6±18516.7)L。以哌喹AUC0-t计算相对生物利用度F为101.6％。双氢青蒿素AUC0-t、 Cmax比值的90％置信区间分别为89.2％～121.9％、83.6％～119.3％;哌喹AUC0-t、 Cmax比值的90％置信区间分别为82.8％～123.7％、80.7％～120.9％;均分别落在80％～125％、75％～133％区间内。
　　 结论:
　　 1.本文建立的高效液相色谱-质谱法简便、灵敏、准确，适用于人血浆中双氢青蒿素和哌喹浓度测定。
　　 2.72名受试者口服双氢青蒿素哌喹片试验制剂或参比制剂后在体内的药动学特征和血药浓度均存在很明显的个体差异，其中哌喹具有高表观分布容积和低清除率，故半衰期很长，其血药浓度-时间曲线出现多峰现象，证实其在体内存在肝肠循环。
　　 体内药动学特征显示，双氢青蒿素和磷酸哌喹的复方制剂不仅在抗疟机制上有协同作用，在药动学和药效学上也存在互补效应。
　　 双氢青蒿素、哌喹主要药代动力学参数AUC0-t、Cmax经90％置信区间分析，显示两制剂间无差异，符合生物等效的假设。即双氢青蒿素哌喹片试验制剂与市售双氢青蒿素哌喹片参比制剂具有生物等效性，为生物等效制剂。整个实验过程顺利，受试者服用双氢青蒿素哌喹片试验制剂或参比制剂后，3名受试者发生轻微不良事件，以上不良事件在短时间内消失，均未服用相关治疗药物。1名受试者试验后肝功能轻微异常，7日内恢复正常，未服用治疗药物，其他受试者试验前后未见实验室检查结果发生有临床意义的改变。
　　 3.对于长半衰期药物哌喹来说，采用AUC0-72和AUC0-672分别评价其生物等效性结果相近，即采取0-72 h的血药浓度-时间点的样本即可满足哌喹生物等效性试验研究。
　　 PKsolver3.0药动学数据分析程序同WinNonLin6.2.1药代动力学软件相比，生物等效性评价结果相近，个体药动学参数虽然相似，但AUC0-t和AUC0-∞总体比WinNonLin6.2.1偏大，Cl和Vd总体比WinNonLin6.2.1偏小，具有统计学差异（P＜0.05），故PKsolver3.0药动学数据分析程序可参考用于常见药动学数据分析和生物等效性评价。

目录

声明

摘要

缩略语说明

前言

第一部分 双氢青蒿素生物样本测定方法的建立

1 仪器药品

1．1 药品与试剂

1．2 仪器

1．3 标准溶液、标准曲线及质控样本的配制

2 方法建立

2．1 色谱条件

2．2 质谱条件

2．3 血浆样本处理

2．4 数据处理

3 方法学确证

3．1 方法特异性

3．2 绝对回收率与基质效应

3．3 标准曲线

3．4 最低定量限

3．5 精密度与准确度

3．6 稳定性

3．7 稀释效应

4 讨论

5 小结

第二部分 哌喹生物样本测定方法的建立

1 仪器药品

1．1 药品与试剂

1．2 仪器

1．3 标准溶液、标准曲线及质控样本的配制

2 方法建立

2．1 色谱条件

2．2 质谱条件

2．3 血浆样本处理

2．4 数据处理

3 方法学确证

3．1 方法特异性

3．2 绝对回收率与基质效应

3．3 标准曲线

3．4 最低定量限

3．5 精密度与准确度

3．6 稳定性

3．7 稀释效应

4 讨论

5 小结

第三部分 双氢青蒿素哌喹片的人体药动学和生物等效性研究

1 试验药物

2 受试者选择

3 试验设计

4 样本分析

5 数据处理

5．1 药代动力学参数计算

5．2 生物等效性评价

6 结果

6．1 健康中国男性受试者单次口服双氢青蒿素哌喹片后双氢青蒿素的人体药代动力学

6．2 健康中国男性受试者单次口服双氢青蒿素哌喹片后哌喹的人体药代动力学

6．3 等效性评价

6．4 试验过程安全性评价

7 讨论

7．1 等效性试验设计

7．2 双氢青蒿素哌喹片的人体药动学研究

8 小结

第四部分 不同统计分析方法对双氢青蒿素哌喹片人体药动学及等效性研究的影响

1 实验方法

1．1 分析软件

1．2 实验设计

2 结果

2．1 72名健康中国男性受试者哌喹药代动力学参数AUC0-72和AUC0-672的比较

2．2 72名健康中国男性受试者由AUC0-72和AUC0-672进行等效性评价的比较

2．3 两种软件主要药动学参数分析结果的比较

2．4 两种软件等效性评价结果的比较

3 讨论

3．1 末端消除相对长半衰期药物哌喹生物等效性评价的影响

3．2 两种药动学分析软件对双氢青蒿素哌喹片人体药动学及生物等效性研究的比较

4 小结

全文结论

参考文献

致谢

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