大蒜素与二烯丙基三硫醚对幽门螺杆菌生物膜的杀菌作用

摘要

目的：
　　 幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，H.pylori）是一种螺旋形，微需氧（生长在低氧气张力），具有鞭毛，革兰氏阴性的细菌。由于其能长期定植于人的胃部，可以引起多种胃部疾病，例如慢性胃炎，消化性溃疡并与胃癌和黏膜相关性淋巴组织淋巴瘤(MALT)的发生有着密切的关系。流行病学研究表明世界范围内一半以上的人口（在发展中国家高达90％）携带有H.pylori，尽管只有约20％的携带者表现出相关的疾病，但H.pylori引起人类感染性疾病仅次于变异链球菌。1994年，美国国立卫生研究所和世界卫生组织癌症研究中心将H.pylori列为第一类致癌因子。
　　 目前，由于没有任何一种抗生素可以根除H.pylori的感染，临床上主要采用质子泵抑制剂PPI（和胶体铋剂）联合两种抗生素构成的三联或四联疗法来治疗H.pylori感染。但是，随着抗生素的广泛使用，H.pylori耐药菌菌株的增多，使得临床治疗效果日益下降，统计显示，经过临床治疗后，仍有约10％～20％的患者存在持续性感染。而近来的研究表明，H.pylori对常用抗生素耐药的原因不仅与其自身基因的遗传学改变有关，而且与H.pylori在感染部位形成的生物膜有着密不可分的关系。
　　 当细菌以生物膜形式存在时，耐药性明显增强（高达1000倍），单纯的抗生素应用不能有效清除生物膜，还可以诱导耐药性的产生。生物膜的耐药机制不同于浮游菌，有效浓度的抗菌药物能迅速杀死浮游生长的细菌和生物膜表面的细菌，但是对于生物膜深处的细菌却难以杀灭。近来的国内外研究显示，蒜素类有机硫化合物不但具有广谱的抗菌作用，对于以生物膜形式存在的白色假丝酵母和葡萄球菌等也有较好的杀灭作用。然而，关于H.pylori所形成BF对抗生素的抵抗作用究竟如何却并不清楚;并且，针对H.pylori所形成BF有效的干预策略的研究尚十分少见。
　　 我们的研究主要探讨H.pylori的BF对抗生素的抵抗作用，以及大蒜素和其衍生物DATS对H.pylori形成BF后的干预效果，探究其中的作用机制，以期为临床预防和治疗提供有效的线索。
　　 方法：
　　 1.微量肉汤稀释法测定克拉霉素和大蒜素以及DATS对浮游状态下的H.pylori的MIC，评价几种药物对浮游状态下H.pylori的杀灭作用。
　　 2.在测得的MIC的基础上，调整药物浓度，做不同药物的时间杀菌曲线。
　　 3.选取H.pyloriNCTC11637为目标菌株，利用NC膜作为载体，建立H.pylori的体外BF模型。
　　 4.在H.pylori体外BF模型的基础上，检测克拉霉素以及大蒜素和DATS对BF干预作用，将结果进行对比。
　　 5.利用扫描电镜观察生物膜形态
　　 6.利用CLSM对不同药物处理后的BF进行分析，探究不同药物处理后BF的结构变化并比较内部不同层次菌体的活性状态。
　　 结果：
　　 1.微量肉汤法药敏试验显示，所选菌株对克拉霉素敏感，不存在耐药现象;大蒜素和DATS对受试菌株也均有良好的杀灭作用。
　　 2.通过时间杀菌曲线发现，所选浓度下大蒜素和DATS对受试菌株的杀灭作用较克拉霉素更为迅速，杀菌效果更佳。
　　 3.成功建立了H.pylori的体外BF模型。
　　 4.用不同浓度的克拉霉素，大蒜素和DATS处理BF后发现，H.pylori在形成BF以后，对克拉霉素的抵抗作用大大增加，所用初试浓度处理后，其活性约有50％的下降，但是随着浓度的提高，其活性并没有更加显著的下降。而大蒜素和DATS处理后，BF的活性呈现显著下降，并且随着药物浓度的升高，其活性水平依次减低，呈现剂量相关性。
　　 5.扫描电镜下可见生物膜表面细菌聚集生长，周围有黏性的基质包裹菌体，中间分布着不规则的孔洞。
　　 6.CLSM结果发现，克拉霉素处理BF后，其表层细菌得到有效的杀灭，而深层细菌活性仍然较高;而经大蒜素和DATS处理后的BF，由表层到深层的细菌都被有效杀灭。并且，经过大蒜素和DATS处理后的BF结构被破坏，变得松散，出现较大的孔洞。
　　 结论：
　　 H.pylori在形成BF以后，对克拉霉素的抵抗作用会显著增强，克拉霉素只能杀灭处于BF外层的细菌，对于处于BF深层的细菌起不到杀灭作用，临床上抗生素治疗H.pylori感染的失败与BF的形成有着密切的关系。大蒜素和DATS可以渗透到BF的深层，对H.pylori形成的BF有较好的杀灭作用。此外，大蒜素和DATS还何以抑制肿瘤细胞MGC的生长，具有抗肿瘤作用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

一、幽门螺杆菌

二、细菌生物膜

三、生物膜的耐药机制

1．实验材料

1．1 菌株

1．2 培养基

1．3 主要仪器

1．4 主要试验试剂及配制

2．试验方法

2．1 细菌培养

2．2 药物最小抑菌浓度的测定

2．3 时间杀菌试验

2．4 XTT比色法

2．5 体外BF模型的建立

2．6 克拉霉素、大蒜素和DATS对H．pylori BF的作用

2．7 扫描电镜标本的制备

2．8 CLSM标本的制备及观察

2．9 数据统计学分析

实验结果

1、药物MIC的测定

2、药物的时间杀菌曲线

3、构建H．pylori体外生物膜模型

4、H．pylori形成BF以后对克拉霉素具有抗药性，提高药物浓度不能增强杀菌效果

5、大蒜素和DATS能够有效地降低BF中H．pylori的活性水平

6、H．pylori的BF经药物处理后扫描电镜形态观察

7、CLSM观察不同药物处理后，BF内H．pylori的活性变化，以及对BF结构的影响

讨论

1、生物膜模型

2、生物膜活性的检测

3、生物膜的干预

结论

致谢

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文目录