Cuevaene生物合成途径研究暨Asm43及Asm44在安丝菌素生物合成中的作用

摘要

本论文主要开展了两部分工作:第一部分是Streptomyces sp.LZ35菌株中多烯化合物cuevaenes的生物合成研究，第二部分是Actionosynnema pretiosum ATCC31565中安丝菌素(ansamitocins)起始单元3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)合成途径中的两个酶的功能研究。
　　 Streptomyces sp.LZ35是一株海洋放线菌。本实验室2011年自该菌中分离鉴定了多烯类化合物cuevaenes，该类化合物的结构已有报道，但尚未见生物合成研究的报道。通过生物信息学分析，我们初步在LZ35菌株的基因组上定位了cuevaenes的合成基因簇。本研究的目的是初步阐明cuevaenes的生物合成及调控机制。主要开展了以下三个方面的工作:1.在LZ35△gdm突变株基础上对cuv基因簇中的8个可能的合成基因和4个可能负调控基因进行了敲除实验，分析其产物的变化推测基因的功能。敲除突变株和回补株的发酵结果显示，Cuv10Cuv10(chorismate hydrolase/Chorismatase/3-HBA Synthase)与FAD结合的单加氧酶Cuv18(FAD-binding monooxygenase)与cuevaenes的合成直接相关;2.开展了Cuv10的体外活性研究，确定了Cuv10在cuevaenes前体3-HBA合成中的作用;3.对两个可能的正调控基因cuv15(LAL)和cuv20(SARP)在LZ35△gdm突变株中进行了组成型过表达，考察其对cuevaenes产量的影响。
　　 橙色束丝放线菌A.pretiosum ATCC31565产生具有强抗肿瘤活性的安莎类化合物ansamitocins。文献报道安莎生物合成共同的mC7N起始单元AHBA，是通过一条与莽草酸途径相平行的氨基莽草酸途径合成的。已经证明kanosamine是AHBA生物合成前体之一，但从UDP-glucose至kanosamine的转化仍没有完全证实。本论文的第二部分内容尝试验证ansamitocin合成基因簇中的asm44和asm43基因在UDP-glucose转化至kanosamine途径中的功能。通过在E.coli中异源表达asm43和asm44，摸索合适的反应条件并进行体外活性测定，试图在体外重建UDP-glucose至UDP-kanosamine的反应，未取得成功;最后，通过pull-down实验对Asm43与Asm44之间可能的相互作用进行了检测，也未获得理想的实验结果。

目录

声明

摘要

符号说明及缩写词

第一章 Cuevaene生物合成途径的研究

1．1 前言

1．1．1 Cuevaene概述

1．1．2 Streptomyces sp．LZ35菌株中cuevaene生物合成途径的分析及基因功能预测

1．1．3 本章实验开展思路

1．2．实验材料

1．2．1 菌株与质粒

1．2．2 培养基

1．2．3 试剂

1．2．4 仪器设备

1．3 实验技术

1．3．1 化学转化

1．3．2 电转化

1．3．3 E．coli化转感受态细胞制备

1．3．4 E．coli电转感受态细胞制备

1．3．5 SDS-PAGE

1．3．6 考马斯亮蓝染色胶内酶解蛋白

1．3．7 接合转移

1．3．8 LZ35基因组的提取

1．3．9 质粒小量抽提验证

1．3．10 碱法抽提质粒

1．4 实验方法

1．4．1 引物信息

1．4．2 Cuevaene基因簇中相关基因的敲除

1．4．3 LAL及SARP基因在LZ35中的过表达

1．4．4 突变株及过表达菌株的发酵和HPLC检测

1．4．5 LZ35△gdm／cuv 10：：Apr与LZ35△gdm／cuv 18：：Apr的回补实验

1．4．6 Cuv 10的功能验证及动力学研究

1．5 实验结果与分析

1．5．1 发酵检测结果分析

1．5．2 Cuv 10的异源表达及活性检测

1．5．3 Cuv 10的动力学特征

1．6 总结与展望

第二章 Asm 43及Asm 44在Ansamitocin生物合成中的功能研究

2．1 前言

2．1．1 安莎霉素概述

2．1．2 起始单元AHBA的生物合成研究

2．1．3 Kanosamine生物合成的研究进展

2．1．4 本章实验开展思路

2．2 实验方法

2．2．1 引物信息

2．2．2 asm 43及asm 44在E．coli中的异源表达

2．2．3 Asm 43及Asm 44、Rif K及Rif L相互作用研究

2．2．4 Asm 43及Asm 44、Rif K及Rif L的活性检测

2．3 实验结果与分析

2．3．1 最佳诱导表达条件的探索及分析

2．3．2 Tag pull-down实验的结果分析

2．3．3 活性检测的结果分析

2．4 总结与展望

附录Ⅰ Streptomyces sp．LZ35中启动子的启动强度检测

附录Ⅱ 以PCR-targeting为基础的基因敲除原理示意图

附录Ⅲ 相关载体的图谱

参考文献

致谢