热纤梭菌及生孢噬纤维粘菌降解结晶纤维素超分子结构分析

摘要

高等植物所产生的纤维素是地球上最丰富的生物聚合物，其干重占整个植物细胞壁的40-60％。随着化石燃料的日益紧缺，如何将不溶性的纤维素转化成生物燃料成了人们所广泛关注的热点。然而，在亿万年的进化过程中，植物进化形成了具有超分子层次特点的细胞壁结构，这种结构以纤维素为核心骨架，外侧包被半纤维素和木质素，其可以有效抵御来自微生物和动物的侵害，起到了结构屏障的作用，即“生物质抗降解屏障(biomassrecalcitrance)”。目前，充分利用纤维素生物质生产乙醇等燃料的主要障碍是缺乏低成本的降解转化技术。
　　 纤维素酶对纤维素的降解是一个超分子结构局部的降解过程，有特定的方向，有特定的接触面，所以是一个非均质的过程，因此，就产生了“有限反应面积的问题”。从而，如何高效降解单根微纤丝甚至如何高效降解多根微纤丝就成了人们关注的新的科学问题。本研究主要从底物变化的角度，利用扫描电镜、原子力显微镜以及切片技术、红外光谱测定、XRD测定等分析热纤梭菌和生孢噬纤维粘菌降解前后结晶纤维素CF11和WhatmanNo1.滤纸的结构等的变化，原位表征热纤梭菌和生孢噬纤维粘菌对结晶纤维素的高效降解效率，期待澄清热纤梭菌等对结晶纤维素的降解机制。本研究主要取得了以下研究成果:
　　 1、以ClostridiumthermocellumLQRⅠ作为菌株的微生物厌氧培养体系的建立。
　　 近年来对于热纤梭菌降解纤维素的效率的研究大都趋于购买纤维小体纯品来对纤维素进行降解，通过对产物进行分析来表征热纤梭菌菌体对纤维素的降解效率，这具有一定的局限性。为了更有效地动态观察热纤梭菌对纤维素的降解效率，同时表征降解过程中底物的变化和产物的变化是非常有必要的，然而，微生物技术国家重点实验室均应用好氧微生物体系进行相关的研究，没有厌氧微生物体系的现成的方法，本文建立了一套本实验室适用的微生物厌氧培养体系。
　　 2、可用于超微结构分析测定的纤维素样品处理方法构建。
　　 热线梭菌在降解结晶纤维的过程中，由于其是通过分泌纤维小体和游离的纤维素酶对纤维素进行降解的，残余的纤维素表面会留有大量的菌体及蛋白等，这对后续的XRD测定以及超微结构分析等都会造成干扰。通过利用0.05M焦磷酸钠4℃过夜反复浸泡，单蒸水100℃煮沸30min的方法，结合红外测定结果发现，基本除去了纤维素表面的蛋白等杂质，适宜用于后续的实验分析。
　　 3、首次实现原子力显微镜对纤维素整体超微结构的观测分析。
　　 本研究主要是利用原子力显微镜等观察热线梭菌等降解结晶纤维素前后，纤维素超微结构的变化，但是，原子力显微镜仅仅只能对纤维素的局部进行扫描，不能很直观地观察到整体结构的变化。通过采取对单根纤维细胞切片的连续扫描，最后利用JPK软件包将所有扫描的图片拼接起来的方法获得单根纤维细胞切片的整体扫描图，便能直观地通过整根纤维细胞的变化情况。
　　 4、热线梭菌降解纤维素过程中纤维素结构观测及酶动力学性质分析。
　　 热纤梭菌可高效降解结晶纤维素。在48-72h内，CF11含量由90％降至60％，PH105的含量由90％降至37％。干燥样品在1625cm-1处的红外吸收峰随降解时间逐渐增强证明在这一过程中纤维表面蛋白含量逐渐增加。XRD测定发现，降解前后结晶纤维素结晶度稳定。以PH105为碳源的发酵过程中，最终可检测到的还原糖的质量为初始底物浓度的11％;CF11为碳源的发酵液中，最终可检测到的还原糖的质量为初始底物浓度的5％。培养基的pH值由7.5下降到6.0左右。对以PH105和CF11为碳源培养的热纤梭菌隔天取样的发酵液进行SDS电泳、活性电泳考染、CMC酶活性电泳、木聚糖酶活性电泳，其结果是是相一致的，SDS电泳用肉眼可以明显分辨的蛋白条带数为18条，其中分子量大于116kDa的蛋白条带数为4条，主要蛋白分子量集中在45-116kDa之间。同时，通过活性电泳考染、CMC酶活性电泳以及木聚糖酶活性电泳图谱可以看出，主要酶活性条带集中在分离胶的上半部甚至浓缩胶点样孔附近，第4天左右具有活性的蛋白含量达到最大值。
　　 5、热纤梭菌以及生孢噬纤维粘菌降解的结晶纤维素表面/切片的原子力显微镜观测。
　　 利用原子力显微镜对热纤梭菌降解的结晶纤维素的观测可以得出，热纤梭菌通过组装纤维小体和分泌游离的纤维素酶系统对结晶纤维素进行剥离式降解，纤维表面平坦整齐，通过切片观测发现纤维素整体微纤丝的量由表面逐渐向里减少，残余的微纤丝排列依然紧密。而生孢噬纤维粘菌由于其既不分泌游离的纤维素酶系，又不形成明显的纤维小体，其对结晶纤维素的降解主要是依靠附着在菌体之上的酶系的作用，从而留下极为明显的直径大小(～470nm)大于菌体直径大小(～270nm)的沟壑状痕迹。不管是哪种菌体降解后残余的纤维素，其微纤丝均排列紧密，结晶度值依然保持稳定。

目录

声明

摘要

缩略词表

第1章 绪论

1．1 植物生物质的组成与结构

1．1．1 植物细胞壁及其结构层次

1．1．2 纤维素及其合成

1．2 纤维素降解工业的经典模式菌株

1．2．1 热纤梭菌

1．2．2 生孢噬纤维粘菌

1．3 降解过程中结晶纤维素结构变化的表征方法

1．3．1 整体水平测定

1．3．2 超微水平测定

1．4 立题依据

第2章 厌氧微生物培养体系的建立

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 培养基

2．1．3 热纤梭菌的培养

2．2 结果与讨论

2．2．1 以烘箱作为培养箱实验结果

2．2．2 以高温培养箱培养的实验结果

2．3 本章小结

第3章 热纤梭菌降解结晶纤维素结构变化的整体测定以及胞外酶谱的动态展示

3．1 材料

3．2 主要仪器和试剂

3．3 实验方法

3．3．1 降解过程纤维素干重的测定

3．3．2 降解后纤维素的浸洗与处理

3．3．3 傅里叶变换红外吸收光谱测定

3．3．4 结晶度测定

3．3．5 发酵液酶活性测定

3．3．6 发酵液中还原糖的测定和寡糖谱的展示

3．3．7 发酵液中的酶谱展示

3．4 结果及讨论

3．4．1 降解过程中整体结构测定

3．4．2 降解过程中pH值、酶活性及还原糖变化的测定

3．4．3 发酵液的寡糖谱和胞外酶谱展示

3．5 本章小结

第4章 热纤梭菌降解过程中结晶纤维素超微结构的变化

4．1 材料

4．2 主要仪器和试剂

4．3 结晶纤维素超分子结构表面变化分析

4．3．1 细菌样品冷冻干燥制样过程

4．3．2 利用SEM分析结晶纤维素表面形貌

4．3．3 利用AFM分析结晶纤维素表面形貌

4．4 切片分析纤维内部结构变化

4．4．1 无水乙醇的再次处理

4．4．2 Spurr树脂制备

4．4．3 样品的包埋

4．5 数字图像定量分析

4．6 结果与讨论

4．6．1 不同碳源培养热纤梭菌的SEM观察

4．6．2 热纤梭菌降解结晶纤维素CF11的SEM观察

4．6．3 结晶纤维素CF11和Whatman No．1滤纸的区别

4．6．4 热纤梭菌降解Whatman No．1滤纸的SEM观察

4．6．5 热纤梭菌降解的Whatman No．1滤纸表面的AFM观察

4．6．6 热纤梭菌降解的Whatman No．1滤纸切片的AFM观察

4．6．7 热纤梭菌降解的CF11切片的AFM观察

4．7 本章小结

第5章 生孢噬纤维粘菌降解结晶纤维素超微结构的变化

5．1 材料

5．2 主要仪器和试剂

5．3 利用AFM分析结晶纤维素表面形貌

5．4 切片分析内部纤维结构变化

5．5 数字图像定量分析

5．6 结果与讨论

5．6．1 以Whatman No．1滤纸为碳源培养的生孢噬纤维粘菌纤维表面AFM观察

5．6．2 生孢噬纤维粘菌降解的Whatman No．1滤纸切片AFM观察

5．7 本章小结

全文总结

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢