副粘病毒HN糖蛋白功能性关键氨基酸定位与促细胞融合机制研究

摘要

第一部分:
　　 新城疫病毒HN糖蛋白HR区域α位氨基酸和N481糖基化位点突变后降低细胞融合和HN-F蛋白相互作用的机制
　　 研究背景:
　　 新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)属于副粘病毒科副粘病毒属，为单股负链不分节段的负链RNA病毒，能引起家禽发生新城疫(Newcastledisease，ND)。ND是一种主要累及呼吸系统和神经系统，进展迅速并且危害最为严重的家禽传染病。人类可因接触病禽和活毒疫苗而引起结膜炎或淋巴腺炎。目前对ND缺乏有效的免疫防治措施，其研究障碍是对病毒与宿主细胞的相互作用过程尚不清楚，因此必须弄清NDV与宿主细胞的相互作用机制。NDV是副粘病毒的典型代表，往往被作为副粘病毒的研究模型。
　　 细胞膜融合是NDV增殖与感染的关键步骤，也是感染细胞的典型病例特征。此过程主要由NDV包膜上的血凝素-神经氨酸酶蛋白（hemagglutinin-neuraminidaseprotein，HN）和融合蛋白(fusionprotein，F)协同完成，提示HN与F蛋白存在相互作用区域，并且与F蛋白的发生相互作用区域可能位于HN蛋白的茎部。目前NDV的HN与F蛋白的相互作用机制尚未完全明了。在NDV的HN蛋白茎部区域内包含两个七肽重复区域(hepadrepeatregions，HR)，分别是HR1(74～88aa)和HR2(96～110aa)，每一个HR形成的α-螺旋结构可能参与HN与F蛋白的相互作用，L74、V81和V88是HR1内的α位点氨基酸，L96、I103和L110是HR2内的α位点氨基酸。有研究表明HR区域内α位点的氨基酸突变对HN蛋白的功能有重要影响，但是否会影响HN与F蛋白的相互作用未见报道。
　　 N-糖基化对NDVHN蛋白的折叠加工和功能都有重要影响。NDV的HN蛋白含有6个潜在的糖基化位点，只有4个潜在的糖基化位点即N119、N341、N433和N481存在N-糖基化，N-糖链的缺失影响NDV的毒力，但是否会影响HN与F蛋白的相互作用尚未可知。
　　 研究目的:
　　 研究NDVHN蛋白的HR区域内α位点氨基酸和N-糖基化位点氨基酸的功能，阐明NDV的HN蛋白促细胞融合及HN与F蛋白的相互作用机制，为有针对性地设计抗NDV感染的疫苗奠定基础。
　　 研究方法:
　　 1.NDV的HN蛋白突变体构建及转染:利用融合PCR与体内同源重组相结合的方法构建α位氨基酸和N-糖基化位点突变体，经测序后确定突变位点。应用LipofectamineTM2000将空载体、HN的野生型、各突变体质粒转染或者和F蛋白质粒共转染预感染的重组痘苗病毒vTF7-3的BHK-21细胞系。
　　 2.放射免疫沉淀以及放射免疫共沉淀:放射免疫沉淀是利用EXPRE35S35S复合物标记总的HN和F蛋白，一半蛋白沉淀物不做处理，另一半蛋白沉淀物经糖苷酶PNGaseF酶切;放射免疫共沉淀是分别利用EXPRE35S35S复合物和sulfo-NHS-SS-biotin标记细胞表面的HN和F蛋白，都采用还原条件下的10％SDS-PAGE进行凝胶电泳，运用PerkinElmerCyclonePlus软件分析。
　　 3.各突变株蛋白细胞表面表达效率及活性测定:流式细胞仪分析细胞表面各突变株蛋白表达效率，Giemsa染色和指示基因法分别定性和定量测定其促细胞融合活性，血吸附法测定其受体结合活性，比色分析法测定其神经氨酸酶活性。
　　 4.统计学方法:用SPSS16.0软件进行统计学分析，实验数据以(x)±s表示，应用t检验对突变株HN蛋白与野生型HN蛋白的测定结果进行比较，P＜0.05为差别有统计学意义。
　　 研究结果:
　　 1.NDV的HN蛋白HR区域内6个α位氨基酸突变体构建成功，分别是L74A、V81A、V88A、L96A、I103A和L110A，它们的促细胞融合活性都有不同程度的降低，分别占野毒株的22.6％、29.9％、24.7％、70.4％、9.1％和17.8％。与F蛋白的相互作用能力减弱，各突变株的细胞表面蛋白表达效率与野毒株相比差别均无统计学意义。除L96A的受体结合活性与野毒株大体一致外，其它突变株的受体结合活性都降低，I103A的受体结合活性降低最多，占野毒株的28.2％。L74A、V81A和L96A的神经氨酸酶活性与野毒株大体一致，V88A也保持了野毒株HN蛋白78.5％的活性，I103A和L110A的神经氨酸酶活性仅为野毒株的5.7％和5.2％。
　　 2.NDV的HN蛋白4个N-糖基化位点突变体构建成功，分别为N119A、N341A、N433A和N481A,4个糖基化位点突变株的电泳速率较野毒株的电泳速率增快。经糖苷酶PNGaseF酶切之后，各突变株与野毒株的电泳速率一致，N481A蛋白沉淀量较少。流式细胞术检测N481A的细胞表面蛋白表达率仅为野毒株的57.5％，而其他3个糖基化位点突变株的细胞表面蛋白表达率与野毒株相比差别无统计学意义。N119A、N341A和N433A仍然保持着和野毒株大体一致的促细胞融合活性，然而N481A的促细胞融合活性降低为野毒株的66.2％。放射免疫共沉淀结果显示N481A与F蛋白的相互作用能力降低为野毒株的53.6％，而其他3个糖基化位点突变株与F蛋白相互作用能力与野毒株相比差别无统计学意义。N481A的受体结合活性和神经氨酸酶活性都明显降低，分别为野毒株的33.4％和6.5％，N119A和N341A突变株的受体结合活性和神经氨酸酶活性与野毒株相比差别无统计学意义，N433A的受体结合活性略有升高，而神经氨酸酶活性降低为野毒株的70.0％。
　　 结论:
　　 1.含有HR区域内α位氨基酸突变的HN蛋白的促细胞融合活性的减少和HN蛋白的突变株与F蛋白的相互作用能力的降低有关，但两者之间不成正比例。
　　 2.含有HR区域内α位氨基酸突变的HN蛋白的受体结合活性、神经氨酸酶活性和HN蛋白的突变株与F蛋白相互作用能力是一个平衡的网络，共同调控着HN蛋白的促细胞融合活性。
　　 3.NDV的HN蛋白HR区域α位氨基酸和N481位点突变后干扰细胞融合和HN与F蛋白相互作用的机制不同。第481位的天冬酰胺突变为丙氨酸后导致HN蛋白折叠和加工异常，从而影响促细胞融合活性及HN与F蛋白的相互作用能力。而HR区域内α位氨基酸突变后可能导致关于激活F蛋白的信号从HN蛋白头部到茎部区域的传导过程中出现变化，导致促细胞融合活性及HN与F蛋白的相互作用能力都降低。
　　 第二部分:
　　 人副流感病毒3型HN蛋白保守氨基酸突变分析
　　 研究背景:
　　 人副流感病毒(humanparainfluenzaviruses，hPIV)为副粘病毒科副粘病毒属的主要成员之一，是一类引起婴幼儿肺炎和下呼吸道疾病的重要病原体。hPIV分为1～4型，其中人副流感病毒3型（humanparainfluenzavirustype3，hPIV-3）不仅引起的疾病最严重，而且此型病毒检出率也最高。但hPIV-3感染宿主细胞的机制却并不清楚。
　　 hPIV-3感染宿主细胞周期包括吸附、穿入、脱壳、病毒基因组及蛋白质的合成、子代病毒颗粒的装配及释放等步骤。hPIV-3与宿主细胞膜的融合包括吸附、穿入和脱壳整个连续的过程。这一融合过程不仅是hPIV-3感染机体的第一道关口，也是病毒完成生命周期的关键步骤和抗病毒药物的主要作用靶点。hPIV-3的表面镶嵌着HN和F糖蛋白，HN糖蛋白必须通过识别并结合宿主细胞膜表面的唾液酸受体，激活F糖蛋白前体F0裂解为F1和F2，启动膜融合过程。
　　 N-糖基化是hPIV-3的HN糖蛋白的一种重要的翻译后修饰。宿主细胞膜表面的内源性凝集素受体和糖链结合蛋白都能与hPIV-3HN蛋白的N-糖链结合并帮助病毒顺利介导膜融合过程，暗示N-糖链在hPIV-3诱导膜融合的过程中发挥重要作用。到目前为止，并没有关于hPIV-3HN蛋白N-糖链功能的研究报道。
　　 hPIV-3的HN蛋白含有两种受体结合/神经氨酸酶活性位点，即Ⅰ型和Ⅱ型受体结合/神经氨酸酶活性位点。R192、D216、E409、R424、R502、Y530和E549是位于Ⅰ型受体结合/神经氨酸酶活性位点内的保守氨基酸，N551和H552为Ⅱ型受体结合/神经氨酸酶活性位点内的保守氨基酸。NDV的HN蛋白的Ⅰ型受体结合/神经氨酸酶活性位点对神经氨酸酶和促细胞融合活性具有重要作用，而Ⅱ型受体结合活性/神经氨酸酶活性位点只对受体结合活性有重要作用，但Ⅱ型位点不是神经氨酸酶活性位点。我们推测hPIV-3的HN蛋白Ⅰ型和Ⅱ型受体结合/神经氨酸酶活性位点可能具有与NDV相似的功能。
　　 hPIV-3的HN蛋白氨基酸序列含有一段六缩氨酸NRKSCS(252～257aa)，与第二个β折叠结构相连，此区域是副粘病毒受体结合蛋白（HN、H和G蛋白）内最长的一段保守氨基酸序列，从hPIV-3的HN蛋白晶体结构分析发现此区域距离受体结合/神经氨酸酶活性位点很近，我们推测可能对HN蛋白的受体结合和神经氨酸酶活性有着重要作用。
　　 对副粘病毒受体结合蛋白的氨基酸序列进行比对，发现hPIV-3的HN蛋白氨基酸序列除了含有最长的一段NRKSCS保守六缩氨酸外，还包含保守三缩氨酸EGR(409～411)、GVV(476～478)和YTT(530～532)，分别位于HN蛋白的第四、第五和第六β折叠结构内。EGR和YTT三缩氨酸位于HN蛋白的受体结合口袋附近，其中E409和Y530也是Ⅰ型受体结合/神经氨酸酶活性位点内的保守氨基酸，β折叠结构的三缩氨酸在副粘病毒科内的受体结合蛋白中具有保守性，暗示三缩氨酸的结构对HN蛋白的功能可能具有重要作用。
　　 研究目的:
　　 1.确定hPIV-3的HN蛋白的N-糖基化位点及受体结合/神经氨酸酶活性位点中保守氨基酸的功能和关键氨基酸;
　　 2.确定hPIV-3的HN蛋白的六缩氨酸和三缩氨酸的功能和关键氨基酸;
　　 3.阐明hPIV-3HN蛋白的促细胞融合及HN与F蛋白的相互作用机制。
　　 研究方法:
　　 1.hPIV-3HN蛋白突变体的构建及转染:利用融合PCR与体内同源重组相结合的方法构建单个和联合突变体，经测序最终确定突变位点。应用LipofectamineTM2000将空载体、HN的野生型、各突变体质粒转染或者和F蛋白质粒共转染预感染的重组痘苗病毒vTF7-3的BHK-21细胞系。
　　 2.放射免疫沉淀以及放射免疫共沉淀:放射免疫沉淀是利用EXPRE35S35S复合物标记总的HN和F蛋白，一半蛋白沉淀物不做处理，另一半蛋白沉淀物经糖苷酶PNGaseF酶切，放射免疫共沉淀是分别利用EXPRE35S35S复合物和sulfo-NHS-SS-biotin标记细胞表面的HN和F蛋白，都采用还原条件下的10％SDS-PAGE进行凝胶电泳，运用PerkinElmerCyclonePlus软件分析。
　　 3.各突变株蛋白细胞表面表达效率及活性测定:流式细胞仪分析各突变株的细胞表面蛋白表达效率，Giemsa染色和指示基因法分别定性和定量测定其促细胞融合活性，血吸附法测定其受体结合活性，比色分析法测定其神经氨酸酶活性，R18探针标记法测定其半融合活性。
　　 4.细胞膜融合动态测定:应用R18探针标记人红细胞膜，加入已经转染目的质粒的BHK-21细胞中，荧光光度计测定0～300S的荧光光度值，绘制动态曲线记录细胞膜融合的动态变化。
　　 5.统计学方法:用SPSS16.0软件进行统计学分析，实验数据以（x）±s表示，应用t检验对突变株与野毒株的测定结果进行比较，P＜0.05为差别有统计学意义。
　　 研究结果:
　　 1.hPIV-3的HN蛋白糖基化位点突变体的构建及功能测定
　　 4个糖基化位点单个突变体G1、G2、G3和G4及四个联合突变体G12、G14、G24和G124构建成功。G1、G2、G4、G12、G14、G24和G124的电泳速率比野毒株稍快，G3的电泳速率与野毒株一致，各突变株蛋白经PNGaseF酶切后，其电泳速率与野毒株都一致。hPIV-3的HN蛋白N-糖基化位点的缺失导致其促细胞融合活性的减少和受体结合活性降低（P＜0.05），但不影响细胞表面蛋白表达效率、神经氨酸酶活性及HN与F蛋白的相互作用能力，但联合突变株不能完全激活共转染的F蛋白的有效裂解。N-糖基化位点的缺失抑制了半融合活性和促进F蛋白启动细胞融合能力。
　　 2.hPIV-3的HN蛋白受体结合位点内保守氨基酸突变体的构建及功能测定
　　 hPIV-3的HN蛋白Ⅰ型受体结合/神经氨酸酶活性位点中的7个保守氨基酸突变体R192A、D216A、E409A、R424A、R502A、Y530A和E549A，以及Ⅱ型受体结合/神经氨酸酶活性位点中2个保守氨基酸突变体N551A和H552A都构建成功。除了N551A的促细胞融合活性略有升高（为野毒株的112.2％）外，其他突变株都有不同程度的降低。各突变株表面蛋白表达率都为野毒株的90％以上，并且差别均无统计学意义。HN蛋白的受体结合位点/神经氨酸酶活性位点中保守氨基酸突变对HN与F蛋白的相互作用并没有影响，但E409A、R424A、R502A和H552A促进F蛋白裂解的能力分别降低为野毒株的54.8％、46.3％、56.3％和43.4％。除N551A受体结合活性与野毒株大体一致（为野毒株的100.1％）外，各突变株的受体结合活性均有不同程度降低(P＜0.05)。E549A和N551A的神经氨酸酶活性与野毒株相比差别均无统计学意义，而其他突变株蛋白与野毒株相比有不同程度的降低（P＜0.05）。除N551A外其它突变株的半融合活性和促进F蛋白启动细胞膜融合能力有不同程度的降低。
　　 3.hPIV-3的HN蛋白六缩氨酸突变体的构建及功能测定
　　 hPIV-3的HN蛋白六缩氨酸突变体N252、R253、K254、S255、C256和S257构建成功。各突变株细胞表面蛋白表达效率与野毒株相比差别均无统计学意义。各突变株与F蛋白的相互作用能力与野毒株相比差别无统计学意义。N252A、R253A、K254A和C256A促进F蛋白裂解的能力分别降低为野毒株的59.1％、17.3％、65.0％和13.2％。S257A的促细胞融合、受体结合和神经氨酸酶活性与野毒株大体一致，其它各突变株的促细胞融合、受体结合和神经氨酸酶活性均有不同程度降低(P＜0.05)。除S257A外，其它突变株蛋白的半融合活性和促进F蛋白启动细胞膜融合的能力都有不同程度的降低。
　　 4.hPIV-3的HN蛋白三缩氨酸突变体的构建及功能测定
　　 hPIV-3的HN蛋白三缩氨酸各突变体E409A、G410A、R411A、G476A、V477A、Y478A、Y530A、T531A和T532A都构建成功。各突变株蛋白的促细胞融合活性都有不同程度的降低(P＜0.05)。突变株细胞表面的蛋白表达效率及其与F蛋白的相互作用能力差别均无统计学意义。E409A、R411A、G476A、V477A、Y478A和H552A促进F蛋白裂解的能力分别降低为野毒株的54.8％、35.5％、35.5％、31.4％、29.8％和11.8％。各突变株的受体结合活性、神经氨酸酶活性、半融合活性和促进F蛋白启动细胞膜融合的能力均有不同程度降低（P＜0.05）。
　　 结论:
　　 1.hPIV-3HN蛋白的N308、N351和N5233个潜在的糖基化位点确实被N-糖基化修饰。
　　 2.N-糖基化位点单个突变和联合突变后HN蛋白的受体结合和促细胞融合活性都有不同程度的降低，两者降低程度成正比。
　　 3.hPIV-3的HN蛋白Ⅰ型受体结合/神经氨酸酶活性位点中的保守氨基酸对HN蛋白的促细胞融合活性起着重要作用，第502位精氨酸(R)是关键氨基酸。
　　 4.第552位组氨酸(H)是Ⅱ型受体结合/神经氨酸酶活性位点内的关键氨基酸。
　　 5.六缩氨酸NRKSCS是hPIV-3HN蛋白受体结合/神经氨酸酶活性位点的组成部分，并且此区域内除S257外的氨基酸突变会降低HN蛋白的促细胞融合活性，第253位精氨酸(R)是六缩氨酸的关键氨基酸。
　　 6.三缩氨酸对hPIV-3的HN蛋白促细胞融合活性有重要影响，其中T532为保守三缩氨酸内的关键氨基酸。
　　 7.hPIV-3的HN蛋白与受体结合前后始终与F蛋白结合在一起形成HN-F复合物，而且F蛋白的激活并不需要占野毒株100％的受体结合活性，例如仅占野毒株54.2％受体结合活性的T531A就能够完全激活F蛋白的有效裂解。
　　 8.各突变株蛋白促细胞融合活性的降低可能与启动细胞融合活性能力的降低有关，促进F蛋白启动细胞膜融合能力不仅与F蛋白的裂解率有关，还会受到HN蛋白受体结合活性的调控。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 新城疫病毒HN蛋白HR区域α位点和N481糖基化位点突变后降低细胞融合和HN-F蛋白相互作用的机制

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

创新之处及不足之处

附图

参考文献

第二部分 人副流感病毒3型HN糖蛋白保守氨基酸突变分析

第一章 人副流感病毒3型洲糖蛋白N-糖链的功能

前言

材料与方法

结果

讨论

第二章 人副流感病毒3型HN糖蛋白受体结合／神经氨酸酶活性位点的功能研究

前言

材料与方法

结果

讨论

第三章 人副流感病毒3型HN糖蛋白六缩氨酸的功能研究

前言

材料与方法

结果

讨论

第四章 人副流感病毒3型HN糖蛋白三缩氨酸的功能研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

创新之处及不足之处

附图

参考文献

致谢

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