拟南芥UDP-糖焦磷酸化酶(AtUSP)在糖核苷酸合成中的应用

摘要

糖类分子（包括单糖、寡糖和多糖）和糖缀合物广泛存在于生物体内，从低等的古细菌、细菌到高等的动物植物中，糖类化合物都发挥着不可替代的作用。结构上，糖类化合物复杂多变，使得糖类化合物蕴含丰富的信息功能，糖链的结构与功能研究已成为生物化学与生物医药学的研究热点。但是天然分离的寡糖、多糖及糖缀合物中糖链结构不均一，增加了研究的困难，因此获得结构均一的糖缀合物是研究它们的结构与功能的前提。
　　 化学法合成糖缀合物步骤复杂，产率低，酶法合成结构均一的糖和糖缀合物成为重要手段，糖基转移酶是酶法合成过程中应用最广泛的工具酶。大多糖基转移酶都以糖核苷酸作为糖基供体，然而糖核苷酸来源少且价格昂贵，制约了对糖缀合物的合成研究。
　　 本论文主要分为两部分研究内容，第一部分是一锅法合成多种糖核苷酸（第二章），作为糖基转移酶合成糖缀合物的糖基供体;第二部分研究了拟南芥来源的UDP-糖焦磷酸化酶AtUSP对不同核苷三磷酸的识别与利用情况，测定了AtUSP对UTP、dUTP和dTTP的动力学参数，并小规模制备了dUDP-Glc和dTDP-Glc。
　　 在糖核苷酸的体外合成中，最为简便的方法是利用补救合成途径进行，补救合成途径中，单糖分子首先需要进行1位的磷酸化，然后在焦磷酸化酶或尿苷转移酶作用催化下合成糖核苷酸。第二章中我们从拟南芥总cDNA中克隆得到了UDP-糖焦磷酸化酶的基因(AtUSP)，对基因进行重组表达得到体外具有活性的AtUSP，结合本实验室之前报道的来自肺炎链球菌的半乳糖激酶(SpGalK)以及商品化的酵母菌焦磷酸酶(PPase)，以一锅法的方式合成糖核苷酸o SpGalK和AtUSP都有较广的底物适应性，对经过化学修饰的天然单糖可能有一定的催化能力，一锅法中，我们从天然单糖或结构经过化学修饰的8种单糖分子出发，成功合成了5种相应的UDP-糖，其中UDP-Gal和UDP-4-N3-Gal产率较高分别达到95％和43％，UDP-Glc和UDP-Fuc产率较低都在30％以下，分别为23％和29％，UDP-2-N3-Gal产率最低只在MS中检测到了产物的生成。在化学反应中，叠氮基团属于反应活性基团，一锅法中我们以较高的产率获得了4位叠氮化的UDP-Gal，为化学法衍生其它C-4位修饰的UDP-Gal提供了物质基础。与肺炎链球菌的UTP-Glc尿苷转移酶(SpGalU)相比，AtUSP对C-4位修饰的Gal-1-P具有较大的容忍力，因此更适合于合成4位修饰的UDP-Gal衍生物。
　　 本文第三章主要进行了AtUSP对不同核苷三磷酸的识别与利用能力的研究，测试的9种核苷三磷酸中，5种为嘧啶型核苷三磷酸(UTP、dUTP、dTTP、CTP和dCTP)，4种为嘌呤型核苷三磷酸（ATP、dm6ATP、GTP和dGTP），其中只有UTP、dUTP和dTTP可以被AtUSP催化，UTP利用率最高达到97％，dUTP和dTTP次之，分别为85％和84％，对其它5种核苷三磷酸均没有反应，分析其原因可能与氢键的形成有关，UTP、dUTP和dTTP的嘧啶环上的C-4位上存在O原子，该处O原子可以与蛋白形成氢键，促进酶与核苷三磷酸的结合，而CTP和dCTP该处的O原子被氨基基团代替无法与酶的相关氨基酸形成氢键，导致AtUSP无法识别，其它四种核苷三磷酸碱基部分不仅无法形成氢键而且结构庞大空间位阻大，影响了酶的识别;核苷三磷酸中核糖部分的C-2’位上的羟基虽然也可能参与氢键的形成，但并不影响酶的识别，只是稍微降低了酶对该核苷三磷酸的利用能力。动力学参数测定显示AtUSP对UTP的Vmax、 kcat和Kcat/Km都远大于dUTP和dTTP，说明AtUSP对UTP的催化效率最高，其最适核苷三磷酸底物为UTP。随后对反应进行扩大，进行了dUDP-Glc和dTDP-Glc的制备，正式分离纯化前我们向体系中加入碱性磷酸酶以彻底降解剩余的核苷三磷酸，简化了后续纯化步骤，通过一步凝胶排阻层析分离得到高纯度的糖核苷酸产物。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 糖类概述

1．1．1 糖类的组成与分类

1．1．2 糖类的结构多样性

1．2 糖生物学平台技术

1．2．1 糖生物学工具酶

1．2．2 功能糖的分离纯化

1．2．3 糖阵列技术

1．3 糖类的合成

1．3．1 寡糖的化学合成

1．3．2 寡糖的酶法合成

1．4 糖核苷酸及其合成

1．4．1 生物体内的糖核苷酸

1．4．2 糖核苷酸的化学合成

1．4．3 糖核苷酸的生物合成途径

1．5 非天然糖在糖生物学研究中的意义

第二章 一锅法合成糖核苷酸

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 载体和菌株

2．2．2 酶、试剂和耗材

2．2．3 培养基和缓冲液

2．2．4 主要仪器

2．3 实验方法

2．3．1 拟南芥UDP-糖焦磷酸化酶基因(AtUSP)的克隆

2．3．2 重组质粒pET15b／AtUSP转化E．coli BL21(DE3)

2．3．3 AtUSP和SpGalK的诱导表达纯化

2．3．4 AtUSP酶活检测

2．3．5 薄层层析(TLC)检测酶活

2．3．6 AtUSP酶活的毛细管电泳检测

2．3．7 一锅法合成UDP-Gal验证

2．3．8 一锅法合成合成UDP-糖条件探索

2．3．9 一锅法合成不同UDP-糖

2．4 结果与讨论

2．4．1 AtUSP重组表达载体的构建

2．4．2 AtUSP和SpGalK的表达纯化

2．4．3 AtUSP酶活检测

2．4．4 一锅法合成UDP-Gal验证

2．4．5 一锅法反应条件优化

2．4．6 一锅法合成多种UDP-糖

2．5 本章小结

第三章 AtUSP的NTP底物广泛性及动力学研究

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 菌株

3．2．2 试剂耗材

3．2．3 培养基和缓冲液

3．2．4 主要仪器

3．3 实验方法

3．3．1 AtUSP表达纯化

3．3．2 AtUSP的NTPs底物特异性性研究

3．3．3 AtUSP对UTP、dUTP和dTTP的动力学参数测定

3．3．4 dUDP-Glc和dTDP-Glc的小规模制备

3．4 结果和讨论

3．4．1 AtUSP对NTPs底物识别特异性研究

3．4．2 AtUSP对UTP、dUTP和dTTP的动力学参数测定

3．4．3 dUDP-Glc和dTDP-Glc的小规模制备

3．5 本章小结

全文总结

附录和附图

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文