一元PiggyBac转座系统及CRISPR-CAS9系统在斑马鱼中的初步应用

摘要

随着人类基因组计划的完成，多个物种的基因组相继得到解析。随之而来，功能基因组学，即对基因功能的研究，越来越得到大家的重视。而研究基因功能的一个重要方法，甚至是首选方法，就是敲除或者突变基因，进而通过造成的表型缺陷来研究其功能。
　　 斑马鱼以其独特的生理学、遗传学和分子生物学优势越来越受到瞩目。研究发现，71.4％的人类基因均在斑马鱼中存在同源基因，其中82％的人类疾病相关基因中在斑马鱼中存在对应基因。对斑马鱼基因功能的研究无疑将加深我们对人类基因作用机制的理解，因而在基因组水平上对斑马鱼基因功能进行系统全面的研究已变得尤其重要。在基因功能研究中，随机突变和定点突变是两种广泛使用且行之有效的方法。本论文从这两个方面对两种突变系统在斑马鱼中的应用做了初步探索。
　　 随机突变方面，我们将piggyBac转座系统同基因捕获元件相结合，意图实现全基因组范围的突变研究。PiggyBa转座子来源于鳞翅目昆虫，已经被证明能够在多种生物和不同类型的细胞系中进行有效转座，其中包括小鼠和斑马鱼胚胎。我们设计并构建了同时包含转座子供体质粒和转座酶辅助质粒的一元系统表达载体，同时选取组成型启动子CMV、性腺特异启动子ZPC和ziwi来控制转座酶的表达。通过分析，我们发现一元系统表达载体可以整合到斑马鱼基因组中，并稳定传递给下一代。我们能够在基因组水平检测到一元表达载体的插入，并能够在转录水平上确定转座酶的表达。我们成功获得的一元系统CMV启动子F0代转基因斑马鱼，但在F1后代中尚未发现突变体。
　　 定点突变方面，我们借助CRISPR-CAS9系统对斑马鱼lgdsla lectin基因进行敲除。我们首先探索了不同浓度的sgRNA和CAS9 mRNA的对斑马鱼发育的影响。24h成活率统计结果显示，当CAS9 mRNA浓度过高时容易导致斑马鱼死亡。而sgRNA浓度在30ng/ul到60ng/ul范围变化时对斑马鱼成活率影响不大。通过共注射CAS9 mRNA和sgRNA，我们发现当sgRNA浓度为40ng/ul以上时能够检测到突变。CAS9 mRNA浓度为50ng/ul时未能检测到突变，而100ng/ulCAS9 mRNA实验组可以检测到突变。TA克隆结果显示，CRISPR-CAS9系统可以引起3-13bp的碱基缺失，总体突变效率约为50％。最终结果显示CRISPR-CAS系统可以有效的敲除斑马鱼lgalsla lectin靶基因。目前约有150条F0代斑马鱼正在饲养中。而成鱼中是否携带突变并稳定传代还有待进一步验证。

目录

声明

摘要

缩写表

概述

研究内容一：一元PiggyBac转座系统介导的基因捕获技术在斑马鱼中的初步应用

第1章 前言

1．1 PiggyBac转座子简介

1．2 基因捕获技术

1．3 本研究的目的、思路和意义

第2章 材料与方法

2．1 实验材料、试剂及仪器

2．2 实验方法

第3章 实验结果

3．1 一元PiggyBac系统CMV启动子转基因斑马鱼的筛选与分析

3．2 一元PiggyBac系统ZPC启动子表达载体的构建

3．3 一元PiggyBac系统ziwi启动子表达载体的构建

第4章 讨论

4．1 一元系统的优缺点

4．2 转座系统的表达控制

4．3 转座系统的活性分析

研究内容二：CRISPR-CAS9系统在斑马鱼lgalsla lectin基因敲除中的初步应用

第1章 前言

1．1 CRISPR-CAS9系统简介

1．2 斑马鱼lgalsla lectin基因简介

1．3 本研究的目的、思路和意义

第2章 材料与方法

2．1 实验材料与方法

2．2 实验方法

第3章 实验结果

3．1 靶位点的查找及确定

3．2 sgRNA表达载体的构建

3．3 sgRNA和CAS9的mRNA的体外转录

3．4 靶位点有效性的检测

3．4 显微注射浓度的探索

3．5 突变类型及效率检测

第4章 讨论

4．1 CRISPR-CAS9系统

4．2 sgRNA和CAS9 mRNA显微注射浓度的探索

4．3 定点突变的检测方法

前景与展望

参考文献

致谢