巩膜核黄素/紫外线A胶原交联的实验研究

摘要

早在1998年，Spoerl等通过不同的胶原交联方法对猪角膜进行胶原交联发现，紫外线A段(ultraviolet-A:UVA)联合核黄素照射，低浓度的戊二醛溶液以及Karnovsky's溶液均可增强角膜生物力学硬度。此后，经过各学科专家的共同努力，经过大量的基础试验研究，于2003年，Wollensak等首次将角膜胶原交联疗法(collagen crosslinking: CXL)用于进展期圆锥角膜的治疗，经过3个月到4年的随诊发现:患者术后散光平均减少2.01D，屈光度数减少1.14D，约65％的患者经过治疗后视力竟然有轻度提高，而且该治疗对角膜和晶状体的透明度、角膜内皮细胞密度、眼压等均无影响。之后，此方法迅速被广大眼科专家所接受，用于进展期圆锥角膜患者的治疗。
　　圆锥角膜的特点是渐进性、非炎性角膜实质变薄，且角膜中央部呈圆锥状前凸;进展性近视有相似的发病特点，在近视进展的过程中巩膜组织进行性变薄，尤其是后极部巩膜，严重者有后巩膜葡萄肿的发生。核黄素/紫外线A胶原交联可以对圆锥角膜疾病的进展起一定的阻止作用，该作用是否适用于巩膜？这一问题引发了眼科学者的思考。Wollensak和Spoerl于2004年将核黄素/紫外线A胶原交联方法用于离体猪和人巩膜发现:经该方法照射后人巩膜和猪巩膜硬度和弹性模量均有显著性增加。但是相对于核黄素/紫外线A角膜胶原交联，巩膜胶原交联的基础研究相对比较贫乏，巩膜胶原交联的治疗参数大多是参照角膜胶原交联的数据;巩膜和角膜组织不管是在纤维的构成还是排列上都是有区别的，因而适用于治疗圆锥角膜的核黄素/紫外线A胶原交联的最佳治疗参数并不一定适用于进展期近视的巩膜治疗。本研究的第一步就是研究适合于兔巩膜的核黄素/紫外线A胶原交联的治疗参数，即在活体兔巩膜上进行核黄素/紫外线A胶原交联，我们将能量密度设为3mW/cm2，对其进行不同时间段的紫外线A照射，根据其生物力学参数的改变和是否对视网膜等眼内组织造成损伤，得出该治疗措施的最佳照射时间。另外，由于伦理学原因，动物试验阶段的巩膜胶原交联疗法是不能直接应用于人巩膜的，而目前我们所能获得的新鲜的人的巩膜是非常有限的;因而猪和兔巩膜通常被作为人巩膜的动物模型。我们研究的第二步就是将第一部研究得出的最佳治疗参数分别应用于离体兔、猪和人巩膜，评估核黄素/紫外线A胶原交联前后的生物力学性能，为找出更适合该试验的、更接近人巩膜的动物巩膜模型提供参考，为巩膜胶原交联的发展提供试验基础。
　　第一部分、兔巩膜核黄素/紫外线A胶原交联最佳照射能量的研究
　　目的:
　　明确在活体兔巩膜上进行核黄素/紫外线A胶原交联的效果，探讨紫外线A能量密度为3mW/cm2时的核黄素/紫外线A兔巩膜胶原交联的最佳照射时间。
　　方法:
　　1、实验设计:本研究中包括36只新西兰大白兔，根据紫外线A照射的时间不同（10，20，30，40，50或60分钟）平均分为6组，能量密度为3mW/cm2，紫外线A波长为365nm，利用不含右旋糖酐的0.1％核黄素作为光敏剂。每只新西兰大白兔仅左眼作为照射眼，进行胶原交联治疗;右眼作为对照眼，不进行任何治疗。所有的新西兰大白兔在治疗后24小时处死，然后将其眼球摘除，在每组试验动物中拿出一只治疗眼做组织病理学检验，其他的均做生物力学测试，测试参数为极限应力、弹性模量及生理范围的弹性模量。
　　2、核黄素/紫外线A胶原交联:将新西兰大白兔全麻后分离左眼鼻上象限结膜及结膜下组织，分离的面积要大于9mm×9mm，用5-0尼龙线在角巩膜缘后2mm做两个固定线，以方便牵拉固定眼球。于照射前15分钟开始点0.1％核黄素溶液，每3分钟点一次，点够5次后，进行紫外线A照射。照射距离为50mm，照射面积为9mm×9mm，每次照射前均需测试紫外线A的发射能量，确保在3mW/cm2水平后才能开始。照射过程中每3min点一次0.1％核黄素溶液。照射完毕后，拆除巩膜缝线，用7-0可吸收缝线缝合结膜及结膜下组织，0.3％左氧氟沙星滴眼液点眼。
　　3、巩膜生物力学测试:在照射区域取2条3mm×12mm的巩膜条带，在INSTRON试验机上进行应力-应变生物力学测试。巩膜条带垂直夹在试验机的两个夹头上，距离为4～6mm;对于测试组，夹头间的巩膜组织均为经过胶原交联的组织。测试进行前先将条带加载-卸载7次循环，然后以2mm/min的加载速度逐渐增加负荷，直至试件被拉断破坏。试件破坏点的应力即极限应力。根据试验得出的数据可计算出照射区巩膜组织的弹性模量以及生理范围的弹性模量。
　　4、组织病理学观察切取照射部位的巩膜、脉络膜和视网膜组织，石蜡包埋，4μm切片，进行HE染色观察照射区域组织的改变情况。
　　结果:
　　1、照射时间为10分钟和20分钟组，极限应力、弹性模量和生理范围弹性模量与未照射组相比均无显著性改变(p＞0.05)。
　　2、照射时间大于等于30分种组，生理范围弹性模量与未照射组相比有显著性增加(p＜0.05)。
　　3、照射时间大于等于40分钟组，极限应力、弹性模量及生理范围弹性模量与未照射组相比均有显著性增加(p＜0.05)。
　　4、照射区域巩膜组织病理学检查均显示有炎症细胞浸润;照射时间小于等于40分钟组均未见有视网膜的损伤;照射时间为50分钟和60分钟组显示有视网膜的损伤。
　　结论:
　　1、核黄素/紫外线A胶原交联可显著增加兔巩膜生物力学性能。
　　2、核黄素/紫外线A胶原交联的照射能量不同可引起不同的交联效果，照射能量过强可引起眼内组织的损伤。
　　3、生理范围弹性模量是一比较敏感的测试胶原交联效果的生物力学指标。
　　4、能量密度为3mW/cm2时，核黄素/紫外线A兔巩膜胶原交联的最佳照射时间是40分钟。
　　第二部分、兔、猪、人巩膜核黄素/紫外线A胶原交联前后生物力学性能的比较研究
　　目的:
　　比较核黄素/紫外线A胶原交联前后猪、兔和人巩膜的生物力学性能，明确在巩膜胶原交联前后的应力-应变生物力学测量上猪巩膜和兔巩膜谁更接近人巩膜，为寻找更好的代表人巩膜的动物模型提供试验基础。
　　方法:
　　1、实验设计:本研究中包含8只成年新鲜离体猪眼，8只成年新鲜离体人眼，以及8只成年新西兰大白兔。对于猪眼和人眼，首先以矢状位方向将其平均分为两半，一半作为试验对照不做任何处理，另一半取一10mm×20mm大小的巩膜组织做核黄素/紫外线A胶原交联用的巩膜试件，制作该巩膜试件时尽量避开眼外肌附着点的位置。新西兰大白兔用空气栓塞法处死，并立即将其眼球取出，由于兔眼球较小，其材料无法满足上述要求，因而其一眼作为试验对照不做任何处置，另一眼做一10mm×20mm的巩膜试件，用于核黄素/紫外线A胶原交联。所有材料在胶原交联前后均放于4度湿房保存。每个经过交联的试件以及对照组均做两条3.5mm×15mm条带，用于应力-应变生物力学测量。测试指标包括:极限应力，4％，6％和8％应变条件下的应力和弹性模量。胶原交联的参数为:0.1％核黄素溶液（不含右旋糖酐）作为光敏剂，365nm波长的紫外线A，其能量密度为3mW/cm2，照射时间是40分钟;每次交联前均需测试紫外线A的发射能量，确保在3mW/cm2水平后才能开始照射。
　　2、巩膜生物力学测试:所有测试条带均在同一测试条件下的INSTRON试验机上进行试验。巩膜条带垂直夹在试验机的两个夹头上，距离为4～6mm;对于测试组，夹头间的巩膜组织均为经过胶原交联的组织。测试进行前先将条带加载-卸载7次循环，然后以2mm/min的加载速度逐渐增加负荷，直至试件被拉断破坏。试件破坏点的应力即极限应力。根据计算机得出的数据可以计算出不同应变条件下的应力和弹性模量。
　　结果:
　　1、8％应变条件下，猪、兔和人巩膜弹性模量分别为2.88±1.55×106 Pa，4.46±4.09×106 Pa，和14.31±8.56×106 Pa;应力分别为231.6±112×103Pa,359.1±305.3×103 Pa，和1078.8±645.8×103Pa;人巩膜的应力值和弹性模量值约是猪巩膜的4倍，是兔巩膜的3倍。
　　2、在同一核黄素/紫外线A胶原交联条件下，兔巩膜在应力和弹性模量上均有显著性提高(p＜0.05);猪巩膜仅在极限应力指标上有显著性提高(p＜0.05);而人巩膜交联前后的所有生物力学指标均无统计学差异(p＞0.05)。
　　结论:
　　1、人巩膜生物力学性能高于猪巩膜和兔巩膜。
　　2、核黄素/紫外线A胶原交联可显著增加巩膜生物力学性能;物种不同其生物力学性能指标的改变量不同。
　　3、相对于兔巩膜，猪巩膜在核黄素/紫外线A胶原交联前后的应力-应变生物力学性能的试验上更接近人巩膜，是相对更好的研究巩膜胶原交联的动物模型。

目录

声明

摘要

符号及英文说明

前言

第一部分 兔巩膜核黄素／紫外线A胶原交联最佳照射能量的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附表

附图

参考文献

第二部分 兔、猪、人巩膜核黄素／紫外线A胶原交联前后生物力学性能的比较研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附表

附图

参考文献

综述 巩膜胶原交联的研究现状

致谢

攻读博士学位期间发表文章情况

学位论文评阅及答辩情况表

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