新型功能纳米材料在电化学生物传感器中的研究与应用

摘要

基于纳米材料所具有的比表面积大、催化活性高、吸附能力强、生物相容性好等诸多优点，针对生物传感器构建的关键环节即生物传感界面的构建和信号标记放大策略，本研究论文引入和制备了一系列不同形貌和结构的纳米材料，包括石墨烯、纳米金、石墨烯复合材料、脂质体、类酶铁酸锌以及树枝状聚合物颗粒，并将这些纳米材料用于传感界面的构建及作为信号标记实现信号放大，达到提高传感器灵敏度、延长传感器使用寿命等目的，以满足临床诊断、环境监测等应用的需要。
　　1.氧化石墨烯-金簇复合物的制备及其对半胱氨酸的催化性能研究。
　　Hummers方法制备氧化石墨烯(GO)，硼氢化钠还原制备牛血清白蛋白保护的金簇(Au NCs)，在超声条件下通过静电吸附作用制备了免连接剂的氧化石墨烯和金簇的复合物，采用透射电子显微镜、原子力显微镜、紫外-可见光谱及红外光谱对其进行了表征，金簇能够有效的装饰于氧化石墨烯表面，电化学研究表明制备的GO-Au NCs具有很好电催化氧化半胱氨酸作用。GO-Au NCs修饰电极在低的氧化电位+0.387 V对半胱氨酸在0.05～20.0μmol/L内催化作用呈现良好的线性关系，检测限位为0.02μmol/L。同时研究表明金属离子、糖、核苷和氨基酸对此测定没有影响。该方法具有制备简单、快速响应、好的稳定性和高的重现性。能够无需分离直接用于尿液中还原态和总的半胱氨酸的测定。
　　2.多孔金-石墨烯复合物敏感界面脂质体包覆辣根过氧化物酶实现信号放大超灵敏检测CA153。
　　采用多孔金/石墨烯(NPG/GN)复合材料作为电化学传感器平台和脂质体封装辣根过氧化物酶作为信号标记用于灵敏检测癌抗原153(CA153)，电化学检测主要基于封装脂质体内部的辣根过氧化物酶释放能够催化过氧化氢氧化电子媒介体硫堇(TH)。在抗原存在下，形成HRP@liposome和TH-NPG-GN夹心结构，随着样品中CA153的增多，越多的HRP@liposome被固定，越多的辣根过氧化物酶被固定在传感器表面，产生更大的电流信号。在最佳条件下，免疫检测的线性范围为2×10-5-40 U/mL，检测限为5×10-6 U/mL。并对血清样品中的CA153含量进行检与商业用的电致化学发光法测定结果相一致。建立的方法具有高的灵敏度、准确度和仪器简单，显然该方法在临床免疫检测具有重要的应用前景。
　　3.基于点击化学方法制备的磁性硅纳米粒子修饰的氧化石墨烯作为类过氧化物酶制备了便携式无酶电化学传感器。
　　采用类酶的磁性硅纳米粒子/石墨烯复合材料作为信号标记和氧化石墨烯修饰丝网印刷的碳电极作为平台制备了可任意处理的电化学免疫传感器用于测定CA15-3。利用水热法制备ZnFe2O4纳米粒子，通过反向微乳液法制备硅包ZnFe2O4的磁性硅纳米粒子，磁性硅纳米粒子通过点击化学反应与石墨烯进行复合，采用原子力显微镜、X-射线衍射和透射电子显微镜进行表征。制备的复合材料具有很好的类酶活性用于肿瘤标志物的检测，CA153捕获抗体固定在氧化石墨烯修饰的丝网印刷碳电极，通过夹心免疫反应对CA153进行检测。该方法简单、低成本、高灵敏和高选择性检测CA153，线性范围为10-3～200 U/mL，检测限为2.8×10-4U/mL，该方法测定结果与商业用电致化学发光测定结果一致。
　　4.电化学传感器同时检测多种乳腺癌肿瘤标志物。
　　通过丝网印刷技术制备了一个含有三个工作电极的多路复用免疫传感器阵列。石墨烯修饰于电极表面加速电子传递，在石墨烯修饰电极上原位合成金纳米用于固定捕获抗体(Ab1)，通过夹心免疫反应碱性磷酸酶标记的抗体(ALP-Ab2)固定在金簇(Au NCs)-石墨烯复合物被固定在传感器，碱性磷酸酶能够催化底物3-吲哚酚磷酸盐水解，产生中间产物吲哚酚还原银离子促使银沉积发生，同时Au NCs-GR复合物也对沉积过程有催化作用。在KCl溶液中通过阳极线性扫描伏安溶出法测定沉积银的含量，溶出峰电流的增加与CA153，CA125和CEA的浓度对数成正比，线性范围分别在5.0×10-3～50 U/mL，1.0×10-3～100 U/mL和4.0×10-3～200 ng/mL;检测限分别为1.5×10-3 U/mL，3.4×10-4 U/mL，1.2×10-3ng/mL;该免疫传感器阵列能够任意处理、简单、快速检测肿瘤标志的组合，无交叉干扰及脱氧处理，显现出了在临床中用于癌症的筛查和即时检测的价值。
　　5.树枝状聚合物封装金纳米粒子用于电致化学发光免疫特异性检测蛋白质。
　　在树枝状聚合物密封金纳米粒子的上面通过共价固定鲁米诺和前列腺特异性抗体(Ab2)作为信号分子制备高灵敏的电致化学发光免疫传感器，捕获抗体(Ab1)固定在Fe3O4@SiO2纳米粒子上，负载抗体的Fe3O4@SiO2纳米粒子放在自制的电制化学发光流通池中，然后通过夹心免疫反应，前列腺特异性抗原(PSA)和信号分子形成夹心免疫结构，在最佳条件下，建立的分析方法具有宽的线性范围0.001～100.0 ng/mL和低的检测限0.3 pg/mL，检测结果与商用的电致化学发光检测一致。因此，建立的电致化学发光分析方法在检测肿瘤标志物方面具有广阔前景。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 课题研究背景

1．2 生物传感器的基本原理

1．3 生物传感器的发展历程

1．4 纳米材料生物功能化方法

1．4．1 非共价组装

1．4．2 共价法

1．4．3 纳米材料与生物分子的特定亲和力

1．5 纳米材料在电化学生物传感器中的应用

1．5．1 碳纳米材料

1．5．2 贵金属材料

1．5．3 磁性纳米粒子

1．6 本论文的选题目的及意义

参考文献

第二章 氧化石墨烯-金簇复合物的制备及其对半胱氨酸的催化性能研究

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 材料与试剂

2．2．2 仪器

2．2．3 氧化石墨烯的制备

2．2．4 金簇的制备

2．2．5 传感器的制备

2．2．6 样品制备

2．3 结果与讨论

2．3．1 氧化石墨烯-金簇复合物的表征

2．3．2 修饰电极的表征

2．3．3 半胱氨酸在修饰电极上的循环伏安行为

2．3．4 电化学柱测条件优化

2．3．5 修饰电极的重现性、稳定性和选择性

2．3．6 分析性能

2．4 实际样品检测

2．5 结论

参考文献

第三章 多孔金-石墨烯复合物敏感界面脂质体包覆辣根过氧化物酶实现信号放大超灵敏检测CA 153

3．1 引言

3．2 实验方法

3．2．1 试剂与仪器

3．2．3 脂质体封装辣根过氧化物酶标记于Ab2的制备

3．2．4 多孔金的合成

3．2．5 免疫传感器的制备

3．2．6 分析方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 石墨烯和多孔金的表征

3．3．2 免疫传感器的电化学特性

3．3．3 传感器比较

3．3．4 条件优化

3．3．5 精密度、重现性、选择性和稳定性

3．3．6 分析性能

3．4 血清样品的检测

3．5 结论

参考文献

第四章 基于点击化学方法制备的磁性硅纳米粒子修饰的氧化石墨烯类过氧化物酶便携式无酶电化学传感器

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 试剂与仪器

4．2．2 炔基功能化氧化石墨烯的制备

4．2．3 ZnFe2O4磁性纳米材料的制备

4．2．4 包磁性纳米粒子的制备

4．2．5 叠氮化的包硅磁性纳米粒子的翩备

4．2．6 二抗炔基化

4．2．7Ab2／MSN／GO复合材料的制备

4．2．8 传感器的制备

4．2．9 检测过程

4．3 结果与讨论

4．3．1 表征

4．3．2 MSN／GO复台材料的类过氧化物酶活性

4．3．3 阻抗表征

4．3．4 实验条件的优化

4．3．5 传感器的特异性、准确性和稳定性

4．3．6 分析性能

4．4 实际样品检测

4．5 结论

参考文献

第五章 电化学传感器同时检测多种乳腺癌肿瘤标志物

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 试剂

5．2．2 仪器

5．2．3 谷胱甘肽-金簇(GSH-AuCs)的合成

5．2．4 PVP保护的石墨烯合成

5．2．5 金簇和石墨烯纳米复合物自组装

5．2．6 ALP-Ab2-AuCs／GR复合物的合成

5．2．7 免疫传感器的制备

5．2．8 免疫分析测定

5．3 结果和讨论

5．3．1 GR和AuCs／GR的表征

5．3．2 免疫复合物和银沉积过程的表征

5．3．3 电化学交流阻抗谱

5．3．4 实验条件优化

5．3．5 免疫传感器的再现性、稳定性和选择性研究

5．3．6 分析应用

5．4 血清肿瘤标志物样品的检测应用

5．5 结论

参考文献

第六章 树枝状聚合物封装金纳米粒子用于电致化学发光免疫特异性检测蛋白质

6．1 引言

6．2 实验部分

6．2．1 试剂

6．2．2 仪器

6．2．3 ECL检测池的构建

6．2．4 Den／AuNPs和Ab2／luminol／Den／AuNPs的制备

6．2．5 Fe3O4@SiO2和Ab1／Fe3O4@SiO2纳米粒子的合成

6．2．6 ECL免疫传感器的构建

6．2．7 ECL检测

6．3 结果与讨论

6．3．1 自制ECL检测池的表征

6．3．2 Den／AuNPs的表征

6．3．3 Fe3O4@SiO2纳米粒子的表征

6．3．4 Den／AuNPs复合物的ECL行为

6．3．5 电化学阻抗

6．3．6 实验条件优化

6．3．7 稳定性、再生性和特异性

6．3．8 工作曲线

6．4 应用

6．5 结论

参考文献

结束语

致谢

攻读博士期间发表论文

Chapter 1 Ultrasensitive Electrochemical Immunosensor for CA 153 Using Thionine-Nanoporous Gold-Graphene as Platform and Horseradish Peroxidase-Encapsulated Liposomes as Signal Amplification

1．Introduction

2．Experimental

2．1．Materials and Apparatus

2．2．Preparation of HRP-Encapsulated Liposomes／Ab2

2．3．Synthesis of Nanoporous gold

2．4．Fabrication of Immunosensor

2．5．Analytical Procedure

3．Results and Discussion

3．1．Characteristics of the Graphene and Nanoporous Gold material

3．2．Electrochemieal Characteristics of Immunosensor

3．3．Comparison ofVariously Sensor

3．4．Optimization of experimental conditions

3．5．Precision，Reproducibility，Seleetivity，and Stability

3．6．Analytical Performance

3．7．Application in Analysis of Serum Samples

4．Conclusion

References

Supporting Information

Chapter 2 Ultrasensitive Electrochemiluminescence Immunoassay for Protein Specific Detection Based on Dendrimer-Encapsulated Gold Nanoparticles Labels

1 Introduction

2 Experimental

2．1．Reagents

2．2．Apparatus

2．3 Fabrication of ECL cell

2．4 Preparations of Den／AuNPs and Abe!uminol／Den／AuNPs

2．5 Synthesis of Fe3O4@SiO2 NPs andAb1／Fe3O4@SiO2 NPs

2．6 Fabrication of the ECL immunosensar

2．7 ECL measurements

3 Results and discussion

3．1 Characteristies of the home-made ECL cell

3．2 Characterization of the Den／AuNPs

3．3 Characterization of Fe3O4@SiO2 NPs

3．4 ECL behaviors of the Den／AuNPs composite

3．5 Electrochemical impedance spectroscopy

3．6 Optimization of experimental conditions

3．7 Stability，reproducibility and specificity

3．8 Calibration curve

3．9 Applications

4 Conclusion

References