TRIM27在卵巢癌细胞生长的作用及机制的研究;新型抑炎因子IL-35在儿童哮喘中的表达及意义的研究

摘要

第一部分:TRIM27在卵巢癌细胞生长中的作用及机制的研究
　　目的:
　　卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌，但死亡率却占各类妇科肿瘤的首位，严重威胁着妇女的生命健康。在卵巢癌中90％属于上皮性卵巢癌，而浆液性囊腺癌是上皮性卵巢癌中最常见的类型。目前临床上对于卵巢癌的治疗主要采用手术并辅助化疗的方法，但因多数卵巢癌患者早期无症状或症状轻微以至于到发现时癌症已经发展为晚期，导致其治疗效果不佳，故5年生存率仍不到30％。目前关于卵巢癌的发病原因不明确，且发生的分子机制也不清楚。因此从分子水平探索卵巢癌的发病机制，寻找有效的卵巢癌的早期诊断和治疗手段已成为近年来卵巢癌研究领域的热门课题。
　　TRIM27(tripartitemotif27)最初是作为RET(Rearrangedduringtransfection)基因（即编码细胞膜受体酪氨酸激酶的基因）的融合伴侣而确认的。TRIM27又称为RET锌指蛋白（RFP），属于锌指蛋白(zincfingerprotein)家族的成员，含有三个结构域，即一个指环结构、一个B-盒式结构和一个卷曲结构域。当TRIM27的这三个结构域与RET基因的酪氨酸激酶区域发生融合时则可在小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3中展现出致瘤活性。目前的研究显示，TRIM27在多种恶性肿瘤如子宫内膜癌、乳腺癌和肺癌中高表达，并且与肿瘤的预后密切相关，提示它可能参与肿瘤的发生与发展，但TRIM27在恶性肿瘤中具体的作用机制目前还不清楚。本课题的研究旨在采用免疫组化的方法检测TRIM27蛋白在浆液性囊腺癌患者组织中的表达情况，分析TRIM27表达与临床及病理参数的相关性，并且探讨利用TRIM27特异性SiRNA下调TRIM27表达后对卵巢癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响以及对增殖相关信号通路分子表达的影响，从而明确TRIM27在卵巢癌发生中的作用及其机制。
　　方法
　　一、病例资料
　　病例样本于取自山东大学附属济南市中心医院妇产科，2001-2012年间的50例浆液性囊腺癌患者手术切除的卵巢癌组织，患者年龄在30-79岁之间，平均为56岁，术前未经放疗或化疗且具有完整病例资料。收集同期16例正常卵巢组织（取自手术切除卵巢的非卵巢疾病患者）作为对照。患者的病理学诊断依据WHO卵巢癌诊断标准，临床分期根据Figo系统。
　　二、免疫组化法检测浆液性囊腺癌和正常卵巢组织中TRIM27蛋白水平的表达
　　应用免疫组化方法检测50例浆液性囊腺癌和16例正常卵巢组织中TRIM27的表达水平，并用x2检验分析浆液性囊腺癌组织中的TRIM27表达与临床及病理参数的相关性。
　　三、TRIM27表达下调对卵巢癌细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响
　　1.首先利用RT-PCR、qRT-PCR及westernblot的方法检测卵巢癌细胞系SKOV3、OVCAR3、CAOV3和3AO中TRIM27的表达情况。
　　2.选择TRIM27相对高表达的卵巢癌细胞系SKOV3和OVCAR3，利用脂质体介导TRIM27siRNA分别转染SKOV3和OVCAR3，无关siRNA作为阴性对照。RT-PCR和westernblot鉴定TRIM27的干扰效率。
　　3.利用CCK8方法检测TRIM27表达下调后对SKOV3和OVCAR3细胞增殖的影响。
　　4.利用集落形成实验检测TRIM27表达下调后对SKOV3和OVCAR3细胞克隆形成能力的影响。
　　5.利用流式细胞术检测TRIM27表达下调后对SKOV3细胞周期的影响。
　　6.利用Annexin/PI法检测TRIM27表达下调后对SKOV3细胞凋亡的影响。
　　四、TRIM27表达下调对卵巢癌细胞增殖相关信号通路的影响
　　1.利用westernblot检测TRIM27表达下调后对SKOV3和OVCAR3细胞中MAPK通路的影响。
　　2.利用westernblot检测TRIM27表达下调后对SKOV3和OVCAR3细胞中AKT通路的影响。
　　结果
　　一、TRIM27在浆液性囊腺癌及正常卵巢组织的表达差异及其临床意义
　　（一）TRIM27在浆液性囊腺癌组织中表达明显上调
　　免疫组化结果显示，在浆液性囊腺癌组织中，18％(9/50)表达呈阴性，20％(10/50)表达为弱阳性，44％(22/50)表达为中度阳性，18％(9/50)表达为强阳性;而在正常卵巢组织上皮中，其中37.5％(6/16)表达为阴性，37.5％(6/16)表达为弱阳性，仅有2例表达为中度阳性和2例表达强阳性。经统计学分析，TRIM27在浆液性囊腺癌组织中的表达明显高于正常卵巢组织上皮(x2检验，p=0.0098)。
　　（二）TRIM27的高表达与患者临床病理Figo分期具有正相关关系
　　将浆液性囊腺癌中TRIM27的表达与临床及病理资料进行统计学分析，结果表明TRIM27的上调表达与患者临床Figo分期有正相关的趋势(p=0.0445)。因Figo分期与肿瘤的大小、是否有转移有关，从而提示TRIM27的表达与肿瘤的生长和转移密切相关。然而，浆液性囊腺癌组织中TRIM27的表达与患者的年龄、肿瘤起源部位和组织病理分化程度均无明显相关性。
　　二、TRIM27表达下调抑制卵巢癌细胞的增殖及细胞周期，诱导凋亡
　　（一）TRIM27在人浆液性囊腺癌来源的细胞系中高表达
　　首先利用RT-PCR和western-blot的方法检测了人浆液性囊腺癌来源的卵巢癌细胞系SKOV3、CAOV3、OVCAR3和人粘液性囊腺癌来源的3AO中TRIM27的表达情况，结果显示TRIM27在上述四种细胞系中均有表达，但是在3AO细胞系中表达很低。实时荧光定量PCR结果显示TRIM27在SKOV3表达最高，OVCAR3中度表达，CAOV3中表达相对较低。
　　（二）TRIM27表达下调抑制卵巢癌细胞的增殖
　　选取TRIM27相对高表达的SKOV3和OVCAR3细胞作为研究对象，利用脂质体介导TRIM27siRNA的转染，用无关siRNA作为阴性对照，经RT-PCR、westernblot鉴定，干扰效率约为50％左右。通过CCK8法检测TRIM27表达下调后对卵巢癌细胞增殖的影响，结果显示在SKOV3和OVCAR3细胞中干扰TRIM27的表达后可明显抑制细胞的增殖能力。
　　（三）TRIM27的下调抑制卵巢癌细胞克隆形成能力
　　利用SKOV3和OVCAR3细胞进行克隆形成实验，结果显示在SKOV3和OVCAR3细胞中，TRIM27干扰组细胞的克隆形成率及所形成的克隆大小明显小于阴性对照组及未处理组(p＜0.05)。
　　（四）TRIM27表达下调抑制卵巢癌细胞的细胞周期
　　利用流式细胞术检测TRIM27表达下调后对卵巢癌细胞周期的影响。结果显示，在SKOV3细胞中，TRIM27干扰组S期细胞比例较阴性对照组或未处理组明显升高(p＜0.05)。
　　（五）TRIM27表达下调促进卵巢癌细胞的凋亡
　　利用AnnexinⅤ/PI法检测细胞早期凋亡发现，在SKOV3细胞中TRIM27表达的下调导致细胞凋亡率明显升高(p＜0.05)。
　　三、TRIM27通过影响细胞增殖相关信号通路发挥作用
　　利用Westernblot检测细胞增殖相关信号通路----MAPK通路和AKT通路，结果表明，SKOV3和OVCAR3细胞中TRIM27表达下调后，p-P38表达明显升高，p-AKT的表达明显降低。然而，p-ERK1/2和p-SAPK/JNK的表达在干扰组和对照组之间没有明显变化。
　　结论
　　1.免疫组化研究显示，与正常卵巢癌上皮组织相比，TRIM27在浆液性囊腺癌组织中的表达明显上调。临床资料分析结果显示，TRIM27的高表达与患者Figo分期呈正相关，提示TRIM27与肿瘤的生长和转移有关。
　　2.体外实验证实，TRIM27表达下调可抑制卵巢癌细胞增殖、克隆形成能力，诱导卵巢癌细胞周期的阻滞，促进卵巢癌细胞的凋亡。
　　3.TRIM27表达下调后可促进p-P38的表达，抑制p-AKT的表达，提示TRIM27可通过影响细胞增殖相关信号通路发挥作用。
　　创新性及意义
　　TRIM27是RET原癌基因的融合伴侣，与肿瘤发生密切相关，然而其在肿瘤中的作用机制尚不清楚。本课题首次发现，与正常卵巢上皮组织相比，TRIM27在浆液性囊腺癌组织中高表达，并与患者的Figo分期显著相关，TRIM27通过促进AKT通路的活化，抑制p-P38的活化，改变细胞周期并抑制细胞凋亡，进而促进卵巢癌细胞的生长和克隆形成能力。以上研究发现为后续进一步探讨TRIM27在卵巢癌中的作用机制奠定了基础，并为治疗卵巢癌的诊断与治疗提供新的靶点。
　　利用ELISA法检测了哮喘患者和对照组的血清中IL-35的蛋白表达，结果表明，血清中IL-35水平在哮喘患者中显著低于健康对照组(p＜0.05)。此外，血清中IL-35水平与IL-4水平之间呈显著负相关(r=-0.3520，p=0.0327)，血清中IL-35和IFN-γ水平之间发现显著正相关性(r=0.3569，p=0.0220)。然而，血清中IL-35与IgE水平(r=-0.2909，p=0.0807)和嗜酸性粒细胞计数(r=-0.1206，p=0.4586)没有明显的相关性。
　　结论:
　　研究证明IL-35mRNA和蛋白水平在哮喘患儿的外周血单个核细胞和血清中都明显下调，并且血清中IL-35水平与血清IL-4水平呈显著负相关性，与血清中IFN-γ水平之间呈正相关关系。
　　创新性与意义:
　　我们首次发现哮喘儿童外周血单个核细胞和血清中IL-35的表达下调，血清中IL-35水平和血清IL-4水平呈显著负相关，与血清IFN-γ水平呈正相关。这些结果提示，IL-35可能参与了哮喘的发病机制，这将为寻找新的哮喘治疗靶点奠定基础。
　　第二部分:新型抑炎因子IL-35在儿童哮喘中的表达及意义的研究
　　目的:
　　哮喘是儿童常见的一种慢性气道炎症疾病，发病率在全世界普遍上升。儿童哮喘已成为严重的全球性健康问题并引起医疗卫生专业人士的重视。儿童哮喘发病原因有多方面，最为重要的原因是由特定的过敏原引发的支气管高反应性。它的特点主要是肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞的浸润和血清总免疫球蛋白E(IgE)的增加。目前认为Th1和Th2应答的不平衡在儿童哮喘发病机制中起着举足轻重的作用。Th2细胞过度应答增加了嗜酸粒细胞的浸润和IgE产生从而引起气道高反应和慢性炎症。
　　白细胞介素35(IL-35)是一种新型的抗炎细胞因子，并已被证明在维持免疫稳态中发挥重要作用。之前有文献报道IL-35在胶原诱导的关节炎小鼠模型中可以有效地减轻炎症反应，并且可以抑制IL-17的产生，增强的IFN-γ的合成。然而，IL-35在人类哮喘的作用尚不清楚。本研究旨在初步探讨IL-35在儿童哮喘中的表达及其临床意义。
　　方法:
　　1.病例样本的选择和收集
　　于2011年3月至2013年11月期间，从山东大学齐鲁儿童医院门诊和住院部收集临床诊断为哮喘的患儿41例，同时收集42例年龄性别相匹配的正常儿童作为对照。儿童哮喘的诊断标准参照中华医学会儿科学分会呼吸学组制定的《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》。
　　2.血清总IgE和嗜酸性粒细胞的检测
　　所有儿童哮喘患者和正常对照的血清，均采用德国马尔堡BNP公司的全自动特定蛋白分析仪对血清中的IgE含量进行检测。采用中国迈瑞公司的BC-5800全自动血液细胞分析仪检测嗜酸性粒细胞的数目。
　　3.儿童哮喘病人和正常对照外周血单个核细胞中IL-35mRNA的表达
　　利用密度梯度离心方法从儿童哮喘患者和正常儿童的外周血中提取外周血单个核细胞。TRIZOL法提取总mRNA，使用天根生化公司逆转录试剂盒得到cDNA。实时荧光定量PCR检测P35，EBI3，P28，P40和GAPDH的表达。
　　4.ELISA方法检测儿童哮喘病人和健康对照儿童血清中IL-35、IL-4和IFN-γ的含量
　　采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测了儿童哮喘患者和正常儿童血清IL-35、IL-4和IFN-γ水平的表达。血清IL-35的检测根据武汉Cusabio公司的ELISA试剂盒说明书进行。血清IL-4和IFN-γ的检测分别按照美国eBioscience公司的人IL-4ELISA试剂盒和人IFN-γELISA试剂盒说明书进行。最后用Pearson法分析了IL-35与EO、IgE、IL-4和IFN-γ之间的相关性。
　　结果:
　　1.哮喘患儿和健康对照组血清IgE水平和嗜酸粒细胞的检测
　　我们首先检测了哮喘患儿和健康对照血清总IgE水平及外周血嗜酸性粒细胞的数量，结果表明，哮喘患儿的血清总IgE水平和嗜酸粒细胞数量显著高于健康对照组。进一步分析，在哮喘患者中，血清总IgE水平和嗜酸粒细胞数量之间无显著正相关关系。
　　2.哮喘患儿和健康对照组血清IL-4和IFN-γ的水平
　　利用ELISA方法检测哮喘儿童和健康对照者血清中的IL-4和IFN-γ的表达，结果显示，儿童哮喘患者中血清中IL-4的水平(p＜0.001)。显著高于健康对照组，但是在哮喘患者血清IFN-γ水平明显低于正常对照组(p＜0.001)。并且，在哮喘患者中，血清IgE和IL-4水平之间有着显著正相关关系(r=0.6009，p＜0.0001)，血清总IgE和IFN-γ水平之间有显著的负相关性。
　　3.哮喘患儿和健康对照组PBMC中IL-35mRNA的表达
　　利用实时荧光定量RT-PCR方法检测了哮喘患儿和健康对照组PBMC中IL-35mRNA的表达。结果表明，与正常对照组相比，哮喘患者外周血单个核细胞中IL-35亚基（P35和EBI3）mRNA的表达显著下调（p＜0.001，P35和p＜0.05，EBI3）。
　　4.哮喘患儿和健康对照组血清中IL-35蛋白的表达

目录

声明

第一部分 TRIM27在卵巢癌细胞生长中的作用及机制的研究

摘要

符号说明

前言

一、TRIM27的结构与生物学特性

二、TRIM27的生物学功能

三、TRIM27与肿瘤的关系

四、研究目的

技术路线

材料

方法

一、卵巢癌细胞系的培养

二、脂质体转染

三、RT-PCR

四、免疫组化

五、Western blot

六、细胞活性检测

七、克隆形成能力检测

八、细胞周期和凋亡检测

九、统计学分析

结果

一、TRIM27在人浆液性囊腺癌和正常卵巢组织中的表达

二、TRIM27在人卵巢癌细胞系中的表达

三、在卵巢癌细胞系中干扰TRIM27的鉴定

四、TRIM27表达下调对卵巢癌细胞增殖的影响

五、TRIM27表达下调对卵巢癌细胞周期和凋亡的影响

六、TRIM27表达下调对卵巢癌细胞中MAPK和AKT通路的影响

讨论

小结

附图表

参考文献

第二部分 新型抑炎因子IL-35在儿童哮喘中的表达及意义的研究

摘要

符号说明

前言

一、哮喘的炎性机制

二、IL-35的特性以及在疾病中的作用

三、IL-35的功能

四、研究目的

技术路线

材料和方法

一、实验试剂

二、实验方法

结果

讨论

小结

附图表

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文