深Ⅱ度烧伤皮肤细胞外基质降解产物的自噬诱导活性及其可再生利用的初步研究

摘要

背景：深度烧伤创面的治疗，特别是对于功能部位的治疗，一直是烧伤外科领域研究的重点和难点。临床显示，大面积深度烧伤患者自体皮源缺乏而导致创面闭合困难，而应用无细胞真皮替代物与自体刃厚皮或培养表皮片复合移植治疗大面积深度烧伤创面不仅解决了创面封闭困难问题，而且还能够明显减轻超薄皮片瘢痕增生和挛缩畸形的产生。然而异源性支架材料存在免疫原性且价格昂贵，难以满足烧伤患者大面积植皮的需要。近年研究显示，保留烧伤变性真皮，同时移植自体刃厚或薄中厚皮片治疗深度烧伤创面，术后移植区功能及外形恢复良好，提示烧伤变性皮肤能可逆性恢复部分真皮功能和形态的特点。大面积深Ⅱ度烧伤患者切痂术后丢弃的变性真皮是否可再利用成为本课题研究的重点。
　　近年，自噬是生命科学最热的研究领域，自噬是真核细胞特有的普遍生命现象，在维持细胞自我稳态、促进细胞生存方面起重要作用，广泛参与多种生理和病理过程。研究显示，溶酶体酶可转移至胞质内侧甚至分泌到细胞外降解ECM，同时细胞发生自噬的机制也与溶酶体酶大量释放有关[1]，推测ECM降解产物与细胞自噬存在某种关联，具有细胞自噬诱导活性。
　　因此，本研究旨在探讨深Ⅱ度烧伤皮肤(DBS)中的ECM降解产物是否具有自噬诱导活性、深Ⅱ度烧伤真皮基质(DBDM)的制备方法、组织相容性以及作为真皮替代物修复深度烧伤创面的可行性。
　　目的：(1)观察自噬相关基因Beclin1在大鼠深Ⅱ度烧伤皮肤(DBS)中的表达，初步探讨自噬与烧伤皮肤之间的关系。(2)探讨DBDM是否具有自噬诱导活性;并探讨利用DBS作为真皮替代物构建复合皮移植模型进行修复创面的可行性。
　　方法：(1)16只雄性Wistar大鼠随机分为正常组（对照组）和烫伤组（实验组），每组各8只。实验组建立DBS模型，烫伤后分别于1、3、7d取材。组织学检查观察各组动物皮肤全层情况，免疫组化检测Beclin1在各组动物皮肤的表达，并行图像处理和统计学分析。(2)真皮支架制作:采用酶消化法[2]，实验组取2只大鼠烫伤24h后皮肤进行脱细胞等处理，制备DBDM;对照组采用Wistar大鼠正常皮肤制备ADM。①埋植实验:20只雄性Wistar大鼠随机分为深Ⅱ度烧伤真皮基质(DBDM)埋植组（实验组）和无细胞真皮基质(ADM)埋植组（对照组），每组10只。各组分别于3d、1w、2w、3w时取材，组织学检查观察真皮支架内细胞生长情况，免疫组化检测各组各时间点Beclin1在真皮支架的表达水平，并行图像处理和统计学分析。②复合皮移植实验:20只雄性Wistar大鼠随机分为深Ⅱ度烧伤真皮基质(DBDM)移植组（实验组）和无细胞真皮基质(ADM)移植组（对照组），每组10只。取新生24h内大鼠乳鼠背部完整皮肤，修薄后与网状DBDM（实验组）一次性重叠移植到大鼠背部约2cm×2cm全层皮肤缺损创面，14d后观察复合皮生长情况。对照组ADM与薄的大鼠乳鼠表皮片重叠进行复合移植，实验方法同实验组。
　　结果：(1)Beclin1蛋白在实验组表达阳性，对照组表达阴性，组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。(2)新鲜制备的DBDM呈浅黄白色，质地较柔软，有一定的韧性和伸展性，较ADM弱。镜下胶原纤维增粗和透明样变，排列紊乱、疏松，无细胞、血管和毛囊等成分存在。①埋植实验:术后各组大鼠创口周围皮肤无明显肿胀及炎性反应，切口愈合良好，移植物与创面组织愈着紧密。组织学观察，DBDM及ADM植入3d时，可见成纤维细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等浸润。植入1w时，各支架内可见大量成纤维细胞侵入、增生，并沿胶原纤维方向分布，新生毛细血管向移植物内部延伸。植入2w、3w时，移植物内血管数量进一步增多，并在移植物内广泛分布。免疫组织化学染色显示，实验组Beclin1蛋白的表达量于1w时达到高峰，实验组和对照组差异有统计学意义(P＜0.05)。②复合皮移植实验:术后14d，两组大鼠及移植物的成活率差异有统计学意义(P＜0.05)，双层复合皮与皮下组织紧密连接，深层DBDM或ADM呈粉红色，未见明显肿胀及炎性反应。与ADM相比，DBDM组移植物较早出现炎性细胞浸润和成纤维细胞、毛细血管长入;炎性细胞以中性粒细胞和巨噬细胞为主，新生胶原蛋白沉积较快，纤维排列规则、致密。
　　结论：(1)Beclin1蛋白在Wistar大鼠烫伤皮肤中的表达呈阳性，推测自噬参与深Ⅱ度烫伤皮肤的修复过程。(2)DBDM来源广泛、制备方法简单，移植物生物相容性好，无皮肤烧伤毒素样反应，具有增强自噬诱导活性，诱导细胞自噬清除受损细胞器，使细胞免于受到进一步损伤及发生凋亡，为转入修复阶段创造条件，具有恢复正常结构的潜力，可充当自体刃厚皮片的真皮替代物。本研究可为今后临床改造和利用烧伤皮肤提供新的思路。