烧伤变性真皮基质可再生利用的初步研究

摘要

背景：深Ⅱ度及混合度烧伤创面的治疗，尤其是功能部位的治疗，一直是烧伤外科领域研究的重点和难点。应用无细胞真皮替代物与自体刃厚皮或培养表皮片复合移植治疗大面积烧伤创面能够明显减轻皮片瘢痕增生和挛缩畸形的产生。然而异源性支架材料的价格昂贵且存在免疫原性，很难满足烧伤整形患者大面积移植的需要。近年研究表明，保留烧伤变性真皮，并复合移植整张自体中厚或薄中厚皮片治疗深Ⅱ度及混合度烧伤创面，术后患处外形及功能恢复良好，提示烧伤变性皮肤具有可逆性恢复正常真皮形态和功能的特点。大面积烧伤患者切痂术后丢弃的变性皮肤是否可再利用成为本课题研究的重点，旨在探讨烧伤变性真皮基质(DDM)的制备方法、组织相容性以及作为真皮替代物修复深Ⅱ度烧伤创面的可行性。
　　 方法：采用Trypsin+TritonX-100脱细胞方法，分别对大鼠深Ⅱ度烫伤后第1、3、7d皮肤进行脱细胞等处理，制备DDM，即DDM-1d、DDM-3d、DDM-7d。相同方法制备大鼠脱细胞真皮基质(ADM)作为对照。对DDM和ADM分别行大体、光镜、超微结构观察及微生物学和生物力学相关检测，并通过HE染色、酶联免疫、流式细胞学等试验技术，观察（变性的）真皮细胞外基质在大鼠异体埋植3d、1w、2w、4w时，胶原变化、组织相容性和炎症免疫反应。
　　 结果：DDM呈乳黄色，质地柔软，有一定的韧性和伸展性，弹性较ADM差。镜下胶原纤维增粗、排列紊乱、疏松，嗜伊红性增强，无细胞、血管、毛囊等成分存在。离体微生物培养呈阴性。DDM-ld、DDM-3d及DDM-7d之间生物力学相关性能指标差异无统计学意义（P＞0.05）;DDM-1d、DDM-3d及DDM-7d与对照组两两比较各项指标差异均具有统计学意义（P＜0.05）。大鼠背部埋植实验:大体观察，术后各组大鼠创口周围皮肤无明显肿胀及炎性反应，切口愈合良好，移植物与创面组织愈着紧密。组织学观察，DDM及ADM植入3d时，可见成纤维细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等浸润。植入1周时，各支架内可见大量成纤维细胞侵入、增生，并沿胶原纤维方向分布，新生毛细血管向移植物内部延伸。其中DDM表皮面的细胞浸润及血管长入较真皮面多，以DDM-3d组为著。各组白细胞介素4(IL-4)、γ-干扰素(INF-γ)、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素12(IL-12)、肿瘤坏死因子-Q(TNF-α)，表达水平较前期增加。实验组与ADM组差异无统计学意义(P＞0.05)。2周时，埋植的脱细胞变性真皮基质呈粉红色，表面可见细小散在的红点。支架内见较多成纤维细胞浸润和血管内皮细胞增生，支架中存在大量中性粒细胞、淋巴细胞及少量巨噬细胞浸润。其中DDM-3d组支架中成纤维细胞和毛细血管数量稍多。各组IL-4、IL-6、γ-干扰素、TNF-Q、IL-12表达量均于2周时达到高峰，其中DDM-3d组γ-干扰素升高最为显著(P＜0.05)。4周时，移植物内血管数量进一步增多，并在移植物内广泛分布，IL-4、IL-6、γ-干扰素、TNF-Q、IL-12表达水平均下降。
　　 结论：DDM来源广泛、制各方法简单，移植物生物相容性好，没有明显的免疫原性和烧伤毒素样作用，虽然有一定的炎症趋化作用，但也因此能够更好地诱导宿主微血管和成纤维细胞长入，经离体改造有望成为大面积深Ⅱ度烧伤治疗的真皮替代物。