血清microRNA作为生物标记物在结直肠腺癌早期诊断中的应用

摘要

结直肠癌(colo rectal cancer，CRC)是常见的消化道恶性肿瘤之一，在我国，结直肠癌死亡率居恶性肿瘤第五位，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势。结直肠癌大多经历了正常粘膜—腺瘤—腺癌的发展过程，即Nornal-Adenoma-Adenocarcinoma(N-A-AC)学说。腺癌是结直肠癌最主要的组织学类型，而腺瘤被公认为结直肠腺癌最重要的癌前病变。结直肠腺癌早期不易发现，大多患者就诊时已到中晚期，尽管诊疗技术不断发展，患者术后5年生存率并无明显改善，缺乏有效的诊断方法实现对结直肠腺癌及其癌前病变的早期诊治是主要的原因之一，若能早期发现并切除结直肠腺癌及其腺瘤病变，将有助于降低其发病率及死亡率。目前，临床上结直肠腺癌早期诊断主要依赖于肠镜、影像学检查和血清学标志物癌胚抗原（Carcinoembryonicantigen，CEA）等，因具有侵入性或敏感性、特异性不足，而无法满足临床需求。寻找敏感性、特异性高的生物标志物用于结直肠腺癌早期诊断仍是临床亟待解决的难题。
　　MicroRNA(miRNA)是一类长度约19-24个核苷酸的非编码小分子RNA，其异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关。近年研究发现，血液中存在丰富而稳定的miRNA，其表达谱具有明显的组织特异性，在不同肿瘤中具有特异的表达谱，是具有潜在价值的肿瘤早期诊断生物标志物。单一miRNA作为标志物的敏感性和特异性仍难以满足临床需求，将差异miRNA组合建立肿瘤特异性表达谱将改进单一分子标志物难以克服的低灵敏度、低特异性问题，成为早期诊断的有效手段。若能获得结直肠癌血清miRNA表达谱，可为其早期诊断提供一条新途径。
　　在miRNA表达研究中，很多因素（如RNA的数量和浓度）可导致样品测定结果出现偏差。目前，RT-qPCR是miRNA定量检测最常用的方法，选用恰当的内参基因是RT-qPCR定量检测数据标准化最常用的方法，在miRNA研究中发挥重要作用。对于结直肠腺癌、腺瘤外周血miRNART-qPCR定量检测，目前尚无适宜内参基因筛选的相关研究报道。
　　基于上述问题，本课题采用高通量Miseq测序技术，对结直肠腺癌、腺瘤和健康对照组的血清miRNA进行了系统分析，确定标准筛选三组间无差异表达的miRNA和三组间渐进性升高或降低的差异表达miRNA，对上述无差异表达的miRNA进一步RT-qPCR验证，并经geNorm、Normfinder软件评估，筛选用于结直肠腺癌血清miRNART-qPCR测定的最适合内参，为下一步结直肠腺癌血清miRNA差异表达检测及数据标准化分析提供了保障;以筛选出的内参基因作为内对照，将上述差异表达的miRNA进行逐个RT-qPCR验证，筛选差异有统计学意义的miRNA，运用ROC曲线评估各差异miRNA的诊断价值;采用多元logistic回归分析方法将差异miRNA引入回归方程，建立logit(P)判别公式，构建miRNApanel;同时，对miRNApanel采用盲法分析，进行大样本临床验证，评估其在结直肠腺癌诊断及鉴别诊断中的应用价值。
　　第一部分：结直肠腺癌血清microRNART-qPCR检测最适内参基因的选择与验证
　　研究目的：
　　实时荧光定量PCR(RT-qPCR)是目前血清microRNA(miRNA)最常用的检测方法，内参基因的选择对获得可靠RT-qPCR分析数据至关重要。本研究旨在对结直肠腺癌患者血清miRNA定量PCR检测中的内参基因进行系统评估与验证，筛选最适内参基因。
　　方法：
　　收集30例结直肠腺癌、25例结直肠腺瘤和30例健康对照血清，采用高通量Miseq测序技术对三组混合样本进行测序，选择在三组样本中表达无差异的miRNA作为候选内参基因;采用RT-qPCR技术在45例结直肠腺癌、40例结直肠腺瘤和40例健康对照血清中对筛选出的候选内参基因和常用内参基因U6snRNA进行验证;利用geNorm和NormFinder两种运算法则评估内参基因的表达稳定性，进一步选择最适内参基因;在60例结直肠腺癌、60例结直肠腺瘤和60例健康对照血清中对筛选出的最优内参基因进行验证，并采用筛选出的内参基因评估miR-92a-3p在结直肠腺癌患者血清中的表达。
　　结果：
　　1.候选内参基因的测序筛选:结直肠腺癌组与腺瘤组、结直肠腺癌组与健康对照组、腺瘤组与健康对照组两两比较发现，拷贝数大于50且两组间表达无差异的miRNA分别为17个、32个和25个。进一步分析，得到三组间表达均无差异的miRNA共13个，作为候选内参基因。
　　2.候选内参基因的RT-qPCR验证:上述候选内参基因中，有5个miRNA(miR-151a-3p,miR-4446-3p,miR-221-3p,miR-93-5p和miR-3184-3p)在音分标本中无法检测到;miR-197-3p和miR-26a-5p的平均Cq值大于35;miR-103b,miR-484,miR-16-5p,miR-3615,miR-18a-3p,miR-191-5p和U6snRNA均可在所有标本中检测到且平均Cq值小于35。
　　3.所选内参基因表达稳定性评估:采用geNorm和NormFinder两个运算软件评估上述7个内参基因的稳定性，GeNorm分析结果显示miR-191-5p，miR-16-5p，U6snRNA和miR-18a-3p可作为内参基因;geNorm和NormFinder均显示miR-191-5p是表达最稳定的内参基因，miR-191-5p和U6snRNA组合是最稳定的内参基因组合。
　　4.最适内参基因的验证:在另一独立大样本中进行验证，结果显示miR-191-5p，U6snRNA和miR-191-5p+U6snRNA组合在结直肠腺癌、腺瘤和健康对照组中表达均无统计学差异，在结直肠腺癌的不同分期患者中表达也无统计学差异。
　　5.MiR-92a-3p分子的表达:采用miR-191-5p+U6snRNA组合作为内参，检测血清miR-92a-3p分子在不同组的表达。结果显示，miR-92a-3p在结直肠腺癌患者中表达高于腺瘤和健康对照组(P＜0.001)，在腺瘤患者中的表达高于健康对照(P＜0.001)。MiR-92a-3p的表达随结直肠癌患者TNM分期的进展而升高，血清miR-92a-3p表达在结直肠腺癌患者Ⅰ期与Ⅲ/Ⅳ期，Ⅱ期与Ⅲ/Ⅳ期，Ⅲ期与Ⅳ期差异均有统计学意义，而在Ⅰ期与Ⅱ期差异无统计学意义（P=0.66）。
　　结论：
　　MiR-191-5p和U6snRNA的组合可作为结直肠腺癌、结直肠腺瘤和健康对照血清中miRNART-qPCR检测的最适宜内参基因。
　　第二部分：结直肠腺癌血清microRNApanel的建立及临床应用
　　研究目的：
　　结直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，目前用于其早期诊断的方法或具侵入性、或敏感性特异性不足尚无法满足临床需求。血清中存在丰富而稳定的miRNA，其作为标志物为肿瘤早期诊断提供了一条新途径。本研究旨在筛选结直肠腺癌差异表达miRNA，进而构建miRNApanel用于结直肠腺癌的早期诊断。
　　方法：
　　收集30例结直肠腺癌、25例结直肠腺瘤和30例健康对照血清，采用高通量Miseq测序技术对三组混合样本进行测序，筛选结直肠腺癌差异表达miRNA，作为候选标志物。采用RT-qPCR技术对上述差异miRNA验证，进一步筛选差异有统计学意义的miRNA，将差异miRNA引入多元logistic回归分析，建立miRNApanel，采用ROC曲线评估该miRNApanel的诊断价值。
　　结果：
　　1.候选标志物的筛选:测序结果显示:结直肠腺癌、腺瘤和健康对照组血清中拷贝数大于10的miRNA分别为348，303和283个。根据确定的筛选标准，miR-195-5p,miR-92a-3p,miR-1290,miR-582-5p,miR-223-3p,miR-136-5p,miR-3074-5p,miR-29a-3p,miR-221-3p,miR-148a-3p,miR-19a-3p和miR-17-3p在健康对照组、腺瘤和结直肠腺癌组呈渐进性高表达，而miR-422a，miR-1260a和miR-4502呈渐进性低表达。
　　2.差异miRNA的RT-qPCR验证:将上述15个差异表达miRNA在80个独立样本中进行RT-qPCR验证，结果显示miR-19a-3p，miR-223-3p和miR-92a-3p在结直肠腺癌组表达高于腺瘤和对照，腺瘤组表达高于健康对照;miR-422a则呈渐进性低表达。进一步在240个样本中检测，ROC曲线评估miR-19a-3p，miR-92a-3p，miR-223-3p和miR-422a诊断结直肠腺癌的AUC分别为0.849，0.871，0.890和0.843。
　　3.miRNAspanel的建立:将miR-19a-3p，miR-92a-3p，miR-223-3p和miR-422a引入多元logistic回归分析，得到结直肠腺癌的判别公式为:logit(P)=0.3313-0.0081*miR-19a-3p-0.0257*miR-92a-3p-0.0406*miR-223-3p+0.1328*miR-422a，该4-miRNApanel诊断结直肠腺癌的AUC为0.960。
　　4.miRNAspanel诊断价值验证:进一步在独立样本中验证发现，4-miRNApanel诊断结直肠腺癌的AUC为0.951(95％CI:0.907-0.978;敏感性和特异性分别为84.3％和91.6％)，高于传统标志物CEA(AUC:0.667，95％CI:0.593-0.735，P＜0.001);在CEA阳性组(＞5ng/mL)，其诊断AUC为0.918(95％CI:0.861-0.957;敏感性和特异性分别为76.79％和85.56％);CEA阴性组（＜5ng/mL），其诊断AUC为0.810(95％CI:0.725-0.818;敏感性和特异性分别为57.14％和86.67％);该4-miRNApanel诊断结直肠腺癌TNMⅠ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ患者的AUC分别为0.942，0.935，0.954和0.983;同时我们还分析了该4-miRNApanel对腺瘤的诊断和鉴别诊断价值，发现其鉴别诊断腺瘤和腺癌的AUC为0.886，区分腺瘤和健康对照的AUC为0.765。
　　结论：
　　血清miR-19a-3p，miR-92a-3p，miR-223-3p和miR-422a可作为结直肠腺癌潜在的肿瘤标志物，构建的4-miRNApanel能够准确区分结直肠腺癌、腺瘤和健康对照者，为结直肠腺癌早期诊断提供了一条新途径，可对现有结直肠腺癌早期诊断方法进行有效补充。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 结直肠腺癌血清microRNA RT-qPCR检测最适内参基因的选择与验证

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

附图表

第二部分 结直肠腺癌血清microRNA panel的建立及临床应用

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

附图表

全文总结

参考文献

致谢

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Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients