脂多糖通过PGE2-EP2信号途径介导肺血管生成并促进乳腺癌肺转移的研究

摘要

研究背景：
　　随着肿瘤发病率和死亡率的逐年升高，恶性肿瘤已成为威胁人类健康最主要的疾病之一。据统计，2014年美国将有1，665，540例新发癌症患者，其中585，720例将死于恶性肿瘤。在美国女性中，乳腺癌的发病率占恶性肿瘤的第一位，死亡率居恶性肿瘤第二位。转移是恶性肿瘤最显著的生物学特征，是临床上大多数肿瘤患者治疗失败和致死的最主要原因。肿瘤转移是多步骤、多因素参与的极其复杂的过程，它受到肿瘤本身和宿主环境等多因素的影响。1889年，Paget率先提出了“种子和土壤”学说，即癌细胞（种子）需要适当的微环境（土壤）生长、浸润和转移，他认为肿瘤微环境在肿瘤进展过程中具有重要作用。炎症是目前已证实的能通过细胞因子、趋化因子、活化氧等调节肿瘤细胞活性来促进转移的环境因素。近年来，随着对恶性肿瘤发生发展机制的深入研究，人们越来越认识到炎性微环境在乳腺癌转移过程中发挥重要作用，炎症与肿瘤转移的关系成为人们研究的热点之一，但其机制目前仍不清楚。本研究通过建立炎症动物模型、乳腺癌肺转移模型及体外实验等研究，旨在探讨炎症在乳腺癌肺转移过程中的作用及可能的机制。
　　研究方法：
　　将50只雌性BALB/c小鼠随机分为5组:
　　①PBS组:腹腔注射磷酸盐缓冲液(PBS);
　　②LPS组:腹腔注射脂多糖(LPS);
　　③PT组:腹腔注射PBS+尾静脉注射4T1细胞;
　　④LT组:腹腔注射LPS+尾静脉注射4T1细胞;
　　⑤LTC组:腹腔注射LPS+尾静脉注射4T1细胞+腹腔注射塞来昔布(Celecoxib，Cele)。
　　其中，PBS组和LPS组:连续3天腹腔注射PBS或LPS（5mg/Kg/d），第4天处死小鼠收集标本;PT组、LT组及LTC组:PT组连续3天腹腔注射PBS，LT组和LTC组连续3天腹腔注射LPS，三组小鼠均于第3天腹腔注射PBS/LPS后4小时给予尾静脉注射乳腺癌4T1细胞1×105/只，第4天起PT组、LT组给予腹腔注射PBS，LTC组给予腹腔注射塞来昔布5mg/kg/d治疗，4周后处死小鼠。所有小鼠眼球取血法收集血清，采用酶联免疫法(ELISA)测定血清血管内皮生长因子(VEGF)、前列腺素E2(PGE2)水平，收集肺组织做病理染色，采用免疫荧光CD31染色比较小鼠肺组织血管的变化，PT组、LT组及LTC组观察肺转移瘤并计数。提取各组小鼠肺组织蛋白，检测VEGF、环氧合酶-2(COX-2)表达水平。体外，4T1细胞给予不同浓度LPS刺激24小时后，使用四甲基偶氮唑盐比色(MTT)方法检测细胞增殖能力。分离正常小鼠的肺血管内皮细胞(MPVEC)并培养，使用VEGF、PGE2、Cele刺激Matrigel基质胶上培养的MPVEC，观察内皮细胞血管生成情况。给予PGE2、PGE2受体激动剂、PGE2受体拮抗剂刺激MPVEC后，ELISA方法检测MPVEC培养上清液中VEGF表达水平，使用Western blot方法检测细胞的VEGF蛋白表达。所有实验数据结果以均数±标准差((x)±s)来表示，采用SPSS16.0统计学软件进行统计分析，两样本比较采用t检验，P＜0.05为有统计学意义。
　　研究结果：
　　1.LPS诱导全身炎症反应
　　LPS组小鼠第2天开始精神萎靡，双眼发红，毛发蓬乱，逐渐消瘦;PBS组小鼠反应敏捷，毛发光亮。LPS组小鼠肺脏体积较PBS组大，明显水肿、充血，肺组织苏木精-伊红染色（HE染色）显示LPS小鼠肺泡壁中断，肺泡腔可见炎性渗出，毛细血管充血扩张。
　　2.LPS促进肺血管生成
　　小鼠肺血管生成情况使用CD31免疫荧光共聚焦显微镜观察，结果显示LPS组小鼠的肺血管走行迂曲、紊乱，血管丛较密集、扭曲，管腔之间相互交通，PBS组小鼠肺血管规则、有序，LPS组小鼠肺血管密度明显大于PBS组。LTC组小鼠给予腹腔注射塞来昔布(5mg/kg/d)治疗，肺组织中CD31阳性细胞较未治疗组（LT组）小鼠明显减少，血管丛规则、有序，密度减小。
　　3.LPS促进乳腺癌肺转移
　　HE染色显示，LT组小鼠肺组织转移瘤数目和浸润区域均明显大于PT组。显微镜下计数肺转移瘤，LT组小鼠肺转移瘤数目平均为(37.5±4.3)个，明显大于PT组(12.1+3.5)个，两组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。LTC组小鼠给予塞来昔布治疗后，肺转移瘤数目较未治疗组（LT组）明显较少，肿瘤浸润区域小于LT组。
　　4.LPS对4T1细胞的增殖无明显影响
　　不同浓度的LPS(0ug/ml、10ug/ml、100ug/ml)刺激4T1细胞24小时后，使用MTT方法检测细胞增殖能力。结果显示，LPS刺激对4T1细胞增值能力的影响无统计学意义(P＜0.05)。
　　5.LPS促进VEGF的产生
　　不同浓度的PGE2(10nM、100nM、200nM)刺激MPVECs24小时后，细胞培养上清液及细胞蛋白中VEGF水平随PGE2刺激浓度增加而升高。各组小鼠血清中的VEGF、PGE2水平使用ELISA方法检测，结果显示，LPS组小鼠血清中VEGF、PGE2水平明显高于PBS组，LT组小鼠血清中PGE2和VEGF水平均明显高于PT组，而塞来昔布治疗的LTC组小鼠血清中生长因子水平均较未治疗组(LT组)明显下降。
　　6.Celecoxib处理MPVECs抑制VEGF诱导的血管生成
　　体外血管生成实验显示，单独使用Celecoxib处理MPVECs，内皮细胞在Matrigel基质胶上形成的管样结构数目较对照组（DMEM培养基）减少;单独使用PGE2、VEGF刺激MPVECs后，内皮细胞形成的管腔样结构生成增多。内皮细胞中先加入PGE2/VEGF，再加入Celecoxib，则PGE2、VEGF盼促血管生成作用受到抑制。
　　7.LPS通过PGE2-EP2通路促进VEGF产生
　　PGE2的4种特异性EP受体激动剂处理内皮细胞后，EP2受体激动剂能使上清液中VEGF水平升高，而EP1、EP3、EP4受体激动剂对VEGF水平无明显影响。EP2受体拮抗剂能使MPVEC培养上清液中VEGF水平下降。
　　结论：
　　1.LPS诱导VEGF产生，从而促进血管生成和乳腺癌肺转移。
　　2.PGE2促进血管内皮细胞产生VEGF是通过PGE2-EP2受体通路介导。

目录

声明

摘要

符号说明及中英文对照

研究背景

材料与方法

1．设备及试剂

2．方法步骤

3．统计方法

结果

1．LPS诱导全身炎症反应

2．LPS促进肺血管生成

3．LPS促进乳腺癌肺转移

4．LPS对4T1细胞的增殖无明显影响

5．LPS促进VEGF的产生

6．Celecoxib处理MPVECs抑制VEGF诱导的血管生成

7．LPS通过PGE2-EP2通路促进VEGF产生

讨论

1．炎症反应对细胞因子水平的影响

2．炎症与血管生成的关系

3．炎症对肿瘤转移的作用

4．信号通路的相关机制

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文