利用随机整合和基因置换策略在瑞氏木霉中异源表达栓菌漆酶的研究

摘要

漆酶(laccase)是一类能够氧化酚类和芳香胺底物的多铜氧化酶，可用于纸浆脱木素、废水处理及生物传感器等，在工业和生物技术领域应用广泛。栓菌Trametessp.AH28-2是白腐真菌的一种，能分泌laccaseA(LacA)、LacB、LacC三种漆酶同工酶，其中LacA为主要酶组分，在降解稻草秸杆的木质素成分、降低制浆废水处理耗氧量方面效果十分明显。LacA编码基因被克隆后，在毕赤酵母（Pichiapastoris）和瑞氏木霉（Trichodermareesei）中均已实现表达。但是，毕赤酵母所分泌重组漆酶的热稳定性较差，最适催化pH降低，pH耐受性范围缩小，而瑞氏木霉所分泌的重组漆酶的酶学特性更接近其原始菌株Trametessp.AH28-2。
　　瑞氏木霉能够大量分泌纤维素酶，是目前研究纤维素降解的重要模式真菌。因为具有强大的蛋白分泌能力和真核生物的蛋白加工修饰特点，瑞氏木霉也是极具潜力的异源蛋白表达真核宿主。瑞氏木霉纤维二糖水解酶CBHI(Cel7a)可占总蛋白分泌量的60％左右，而且该编码基因cbh1为单拷贝，所以cbh1启动子Pcbh1是异源蛋白表达时常采用的强启动子。另外，鉴于真核生物染色体的转录具有位置效应，cbh1基因位点也可能是潜在的高效基因转录表达的位点。因此，本研究一方面采用cbh1基因强启动子Pcbh1控制下的LacA编码基因（lacA）直接随机整合入瑞氏木霉染色体中进行异源表达;另一方面，利用cbh1基因位点作为靶位点将lacA基因整合入染色体来研究LacA的异源表达情况。本研究利用上述两种表达策略探索了瑞氏木霉高效表达异源漆酶的潜力，同时，也分析了非折叠蛋白响应及内质网相关蛋白降解途径的诱发情况。
　　第一部分工作利用随机插入策略表达异源漆酶研究。首先，采用Double-jointPCR及分子克隆技术构建了Pcbh1控制的lacA基因表达载体pCGTLacA。该载体包括瑞氏木霉Pcbh1为启动子控制的含有cbh1信号肽序列的lacA表达盒（Pcbh1-lacA）、乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因表达盒（pyrG，作为筛选标记）以及瑞氏木霉cbh1基因下游序列（Tcbh1）。以pCGTLacA为模板，PCR扩增lacA表达盒和pyrG表达盒片段Pcbh1-lacA-pyrG用于随机整合，片段纯化后转化瑞氏木霉原生质体，在无尿嘧啶平板中筛选转化子126株，通过ABTS平板显色法直接筛选表达漆酶菌株，然后进行PCR分析及Southernblot等分子水平的验证，最终确认7株分别含有lacA基因1或2个拷贝数的重组菌株。采用多种培养基进行发酵条件优化，但菌株生长状况一直不佳，胞外蛋白分泌量较低，且未检测到漆酶活力。为了深入分析异源漆酶LacA基因的转录和表达分泌情况，随后利用菌体转接诱导方法检测了Tulac118转化子在乳糖诱导条件下的漆酶基因lacA表达水平，以及非折叠蛋白压力响应(UPR)和内质网相关降解途径(ERAD)相关因子的表达水平。结果显示Tulac118中lacA基因成功转录，并在12h时表达量最高;UPR相关因子分子伴侣bip1略有上调但明显低于DTT处理菌株，然而ERAD相关因子上调程度十分明显，其中，识别错误折叠蛋白底物的泛素化连接酶E3编码基因hrd1在诱导8h时上调幅度为DTT处理的菌株的5.46倍。这说明在液体发酵条件下，Tulac118菌株中异源漆酶LacA在折叠和分泌过程中遇到了障碍，这可能是本实验条件下漆酶LacA没有分泌到胞外的原因。
　　第二部分工作利用基因定位置换策略表达异源漆酶。以pCGTLacA为模板扩增可以置换cbh1基因位点的含有lacA表达盒的片段Pcbh1-lacA-pyrG-Tcbh1。该片段中Pcbh1既是lacA基因表达的启动子元件，又与Tcbh1共同作为置换瑞氏木霉cbh1基因位点的上游和下游同源臂。将该片段转化瑞氏木霉原生质体，在无尿嘧啶平板上筛选转化子，然后进行PCR验证、平板显色鉴定，筛选到实现cbh1位点被lacA定点整合的目的菌株TLac3。利用菌体转接诱导方法检测了TLac3菌株lacA基因表达情况。与对照菌株cbh1基因表达水平相比，lacA基因的诱导约晚10h，但其最高表达量与cbh1相当。同时，在TLac3菌株中检测到UPR相关因子bip1和pdi1转录大幅上调，且在诱导9h时均高于DTT处理菌株;ERAD相关因子也明显上调，但与DTT处理菌株相当。这说明，TLac3菌株中异源LacA的表达诱发了显著的UPR响应，并在一定程度上激活了ERAD途径，但ERAD上调程度不如TuLac118显著。在随后的发酵培养中，成功检测到漆酶活力，最高活力为168.32U/L。重组漆酶最适催化温度35℃，最适催化pH为4.0，pH耐受范围为2.4-8.0。上述结果显示，lacA基因通过置换cbh1基因位点成功表达，重组蛋白分泌到胞外，酶学性质稳定。