质粒介导的喹诺酮抗性基因在环境污水中的分布及相关耐药肠道细菌的筛选

摘要

自从第一代喹诺酮类药物-萘啶酸-出现以来，作为一种广谱抗生素，喹诺酮类药物被广泛应用于治疗人类及动物病原微生物引起的疾病，由此带来的耐药问题也日益严重。几十年过去了，科学家仍在不断地研究开发新的药物以应对这类抗生素的抗性问题。但是好像在这场“战争”中，细菌总是取得胜利的一方。迄今为止，发现了两种喹诺酮抗性机制，他们分别由染色体及质粒介导。其中染色体介导的药物靶蛋白的突变被认为是主要的抗性机制。1998年首次发现了质粒介导的喹诺酮抗性(PMQR)基因，称之为qnrA基因。随后，世界各地的科学家发现了其他四种qnr基因，除了Qnr蛋白外，还有两个额外的PMQR机制，氨基糖苷乙酰转移酶的变体Aac(6')-Ib-cr及外排泵QepA。这些机制虽然只能赋予细菌低水平的抗性，但是可以水平转移扩散，并促进高水平的抗性产生。因此研究PMQR基因在环境中的分布及传播情况意义重大。本实验主要研究了济南地区水环境中细菌的耐药情况及质粒介导的喹诺酮抗性基因的分布，评估抗生素污染对生态环境造成的影响。
　　我们从济南地区医院废水、城市污水处理厂废水和小清河中提取总基因组，通过荧光定量PCR的方法对其中的qnrA基因及16SrRNA基因进行定量，分析qnrA基因的分布情况。qnrA基因的含量由多到少依次为医院废水，城市污水处理厂废水、小清河。研究还显示qnrA基因的含量与水样中的细菌含量成正相关。
　　同时我们从上述废水样品中分离筛选出753株耐药的革兰氏阴性菌株，检测了五种质粒介导的喹诺酮抗性基因。得到含有质粒介导的喹诺酮抗性基因的菌株371株，占所有筛选菌株的49.26％。其中236株含有qepA基因，119株含aac(6')-Ib-cr基因，118株含有qnrS基因，27株含有qnrA基因和22株含qnrB基因。这753株细菌还进行了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型整合子的检测，含有Ⅰ型整合子的有548株，Ⅱ型整合子的有16株。同时含有Ⅰ型和Ⅱ型整合子的细菌有14株。未发现含有Ⅲ型整合子的细菌。含有整合子的细菌的基因盒检测共发现了22种不同的基因盒阵列。
　　为了得到环境微生物群落结构与质粒介导的喹诺酮抗性基因qnrA之间的关系，我们还采取基于16SrRNA基因的Miseq高通量测序平台对样品进行高通量测序，结果显示，五个取样点的物种多样性水平较为稳定，没有显著差异性，光大水务站点的丰富度是最高的。在所有样品中含量都较高的两种细菌门类是变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes），在各种污水水体中，较为广泛存在的菌种有不动杆菌（Acinetobacter），黄杆菌（Flavobacterium）拟杆菌（Bacteroides），假单胞菌（Pseudomonas）弓形杆菌(Arcobacter)。与qnrA基因的存在相关联的两种细菌类型为Rheinheimera和Cloacibacterium。