铜绿假单胞菌T6SS效应蛋白Tse3和人天然免疫蛋白STING结构和功能研究

摘要

细菌六型分泌系统(T6SS)利用自身注射器样的分泌装置，以直接接触的方式注射多种效应蛋白到与其比邻的同种或者异种的细胞中，导致异种受体细胞死亡或生长停滞。同时为了使自身细胞免受这些效应分子的毒害，T6SS+细菌同时表达与各种效应分子对应的同宗免疫蛋白(cognateimmunityprotein)而使其失活。这种效应蛋白和免疫蛋白对(E-Ipair)使拥有T6SS的细菌在与其它细菌竞争中保持了优势。通过分泌组学和质谱的方法，在铜绿假单胞菌中鉴定出三种受H1-T6SS控制的效应蛋白Tse1、Tse2和Tse3。其中Tse1和Tse3分别降解敌对细菌中细胞壁成分的肽侧链和糖主链部分。本文利用X-射线晶体学技术研究了效应因子Tse3和Tse3-Tsi3复合物的三维结构，揭示了Tse3除含有一个C端的溶菌酶结构域以外，N端还含有一个annexinrepeat-like结构域;来源于N端结构域的loop12和C端结构域的螺旋α9在钙离子存在下把Tse3和Tse3-Tsi3锚定到膜上;膜锚定对于Tse3的活性是必需的;Tse3可以利用Tse1的产物作为底物，首次发现了T6SS效应蛋白之间的协同效应;发现在Tse3催化中心和底物结合位点分别含有一个钙结合基序，它们对催化活性也是必需的。另外，Tse3-Tsi3复合物的结构揭示了Tsi3通过三个功能性loop结合到Tse3的活性中心而使其失去结合底物的能力，并发现Tsi3对Tse3的抑制也是钙依赖的，即Tsi3是一种新颖的G-型溶菌酶抑制剂。Tse3和Tsi3结构与功能的研究丰富了我们对T6SS效应蛋白的认识，并为控制病原菌感染提供了必要的结构基础。
　　在高等生物天然免疫系统中，STING蛋白是细胞内对双链DNA(dsDNA)免疫应答的重要接头分子。细胞内的DNA感受器能把dsDNA信号传递给STING蛋白，STING招募下游的激酶分子TBK1，使其磷酸化转录因子IRF3，磷酸化的IRF3二聚化而进入核内，使INF-β表达上调，继而激活病原菌入侵应答。最近发现的CDNs信号通路使我们对STING介导的dsDNA信号通路的认识更加深入。我们借助X-射线晶体学的方法解析了人源STING蛋白的C端结构域(CTD)及其与细菌第二信使c-di-GMP复合物的三维空间结构。我们的晶体学结构显示h-STINGCTD以二体发挥功能，c-di-GMP的结合并没有使h-STINGCTD构象变化，而人细胞内第二信使2'5'-cGAMP则可引起h-STINGCTD构象从open到close的变化，位于β2-β3的loop变为了反平行的β片层盖子结构把CDNs封闭在二体形成的口袋内;同时体内实验显示h-STING并不对c-di-GMP的刺激产生免疫应答，鉴于Ⅰ型干扰素可能有利于细菌的侵染，推测细菌很有可能通过模拟真核细胞的第二信使来劫持宿主的天然免疫系统。人的STING蛋白则通过对c-di-GMP不响应，成功地逃避了细菌的劫持，这在进化上对人类是有利的。而小鼠的STING蛋白则对所有的CDNs应答，并且其构象始终保持close的状态，这提示了STING蛋白在天然免疫中的物种间的差异性。总之，STING结构的解析，为我们治疗病原侵染和自身免疫疾病提供了重要的结构基础。