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特异性结合铜绿假单胞菌六型分泌系统免疫蛋白的多肽的设计及其抗菌活性的验证

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本发明公开了一类特异性结合铜绿假单胞菌六型分泌系统免疫蛋白的多肽的设计及其抗菌活性的验证。本发明首先保护一种多肽，为序列表的序列3所示的多肽或序列表的序列4所示的多肽。编码所述多肽的基因也属于本发明的保护范围。本发明还保护所述多肽的应用：结合细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白；富集细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白；检测细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白。本发明提供的功能短肽可以与效应蛋白竞争性结合免疫蛋白，从而破坏TplE‑TplEi互作，从而促使效应蛋白裂解细菌自身的细胞膜引发细菌自我死亡，这将是一个最有力的以T6SS效应蛋白为靶点的新型抗菌策略，为临床耐药菌株的治疗提供新方向。

著录项

公开/公告号CN108129555A

专利类型发明专利
公开/公告日2018-06-08

原文格式PDF
申请/专利权人中国医学科学院病原生物学研究所;
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申请/专利号CN201710811434.3
发明设计人崔胜;高小攀;牟志霞;秦博;
展开▼

申请日2017-09-11
分类号C07K14/00(20060101);C12N15/11(20060101);A61P31/04(20060101);
代理机构11245 北京纪凯知识产权代理有限公司;
代理人关畅;何叶喧
地址 100176 北京市大兴区经济技术开发区地盛西路北工大软件园7号楼117
入库时间 2023-06-19 05:32:39

法律信息

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态
2020-04-28

授权

授权
2018-07-03

实质审查的生效 IPC(主分类):C07K14/00 申请日:20170911

实质审查的生效
2018-06-08

公开

公开

说明书

技术领域

本发明涉及特异性结合铜绿假单胞菌六型分泌系统免疫蛋白(TplEi)的多肽的设计及其抗菌活性的验证，具体来说，本发明基于蛋白质三维结构设计靶向细菌六型分泌系统效应蛋白-免疫蛋白(TplE-TplEi)相互作用的多肽，发现其具有抗菌活性，具有抗感染药物研发前景。

背景技术

二十世纪以来，致病细菌引发的传染病仍然是全球公共卫生的重大威胁。抗生素的滥用不断加剧着多耐药和泛耐药菌株的出现，尤其近些年来发现对多粘菌素产生抗性基因MCR-1的发现，更为致病细菌的防治带来了前所未有的挑战。铜绿假单胞菌是临床耐药菌中最为典型的代表，其广泛存在于自然界中，可通过环境污染、交叉感染、内源性感染和医源性感染等途径传播，是引发肺炎和手术感染的重要院内感染菌，特别是免疫功能低下患者和ICU病人。此外，铜绿假单胞菌也是囊性纤维化(cystic fibrosis)病人呼吸道感染和慢性阻塞性病人的诱。目前铜绿假单胞菌已经成为医院感染的重要条件致病菌，约占我国医院感染病例数的11.1％-24.5％，居第2-3位。而在全球范围内，铜绿假单胞菌感染已经跃为首位。而这些感染病例中绝大数是由多耐药(MDR)和泛耐药(XDR)铜绿假单胞菌引起,多耐药(MDR)和泛耐药(XDR)铜绿假单胞菌已经对抗生素最后一道防线-多粘菌素产生耐药。因此，设计和研发新型抗感染药物迫在眉睫。

目前，多种新型的抗生素替代物正在研发中，比如，Kenneth Shatzkes和其同事在老鼠动物模型中利用捕食细菌来杀死肺炎球菌。噬菌体治疗因其高度的特异性也备受关注，针对铜绿假单胞菌的噬菌体已被鉴定并应用。此外，抗菌肽(AMP)和金属离子也在研发中。治疗铜绿假单胞菌感染的最常用的方法是抗生素和噬菌体治疗。然而，噬菌体抗体的出现和药物抗性等加剧使这些治疗手段的失效。抗毒力的策略(Antivirulence strategies)是最近提出的抗感染药物研发新思路。通过干扰细菌分泌系统，抑制细菌毒力能够解除致病细菌的“武装”使其丧失毒力同时又不直接杀死细菌。由于这种抑菌策略不直接危及细菌生存，因而具有较小的选择压力，能够延缓耐药突变的出现，引发国际相关领域极大关注。

细菌的分泌系统是一类能够帮助细菌向宿主细胞或异己细菌输送毒力效应蛋白的一种高度特异化、横跨多层细菌被膜的生物大分子复合体。目前在细菌中已经发现7种分泌系统(T1SS-T7SS)。细菌Ⅵ型分泌系统(T6SS)是最近才被发现和描述的一种细菌分泌系统，广泛存在于致病性革兰氏阴性菌中，通过分泌效应毒素蛋白介导了细菌间、细菌与宿主间的相互作用，在细菌的存活以及致病中发挥着重要作用。T6SS通常包括13-25个蛋白构成的核心组件或若干个辅助组件，这些蛋白按功能可分为结构蛋白、效应蛋白、调节蛋白和分子伴侣蛋白。效应蛋白作为T6SS发挥功能的终端产物，直接参与了细菌间的竞争和宿主的致病性。因此，T6SS及其效应蛋白是药物设计的理想靶标。在过去的几年中，T6SS分泌系统的效应蛋白陆续被鉴定出来。最早被发现分泌到细胞外的是T6SS的结构组件VgrG和Hcp，VgrG通过交联真核宿主的肌动蛋白引发感染。随后，降解细菌细胞壁的效应蛋白(Tae/Tge)、降解细胞膜的效应蛋白(Tle)、降解核酸的效应蛋白等陆续被报道出来。有趣的是，为了使自身细胞免受这些效应蛋白的毒害，T6SS⁺细菌同时表达与各种效应分子相对应的同种免疫蛋白或抗毒蛋白(cognate>

发明内容

本发明的目的是设计一种与六型分泌系统免疫蛋白TplEi蛋白特异结合的、具有抗菌活性的多肽。

本发明首先保护一类多肽，为如下(a1)、(a2)、(a3)、(a4)、(a5)、(a6)、(a7)或(a8)：

(a1)序列表的序列3所示的多肽；

(a2)将(a1)进行1-5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与其具有相同功能的由其衍生的多肽；

(a3)序列表的序列4所示的多肽；

(a4)在(a1)或(a3)的N端或/和C端连接标签得到的多肽；

(a5)在(a1)或(a3)的N端连接信号肽得到的多肽；

(a6)序列表的序列11第1至57位氨基酸残基组成的多肽；

(a7)在(a1)或(a3)的N端连接信号肽且C端连接标签得到的多肽；

(a8)序列表的序列11所示的多肽。

编码所述多肽的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)或(b6)：

(b1)编码区如序列表的序列10第70-171位核苷酸所示的DNA分子；

(b2)编码区如序列表的序列10第70-159位核苷酸所示的DNA分子；

(b3)编码区如序列表的序列10第1-171位核苷酸所示的DNA分子；

(b4)编码区如序列表的序列10所示的DNA分子；

(b5)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的DNA序列杂交且编所述多肽的DNA分子；

(b6)与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述多肽的DNA分子。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

本发明还保护所述多肽的应用，为如下(c1)或(c2)或(c3)或(c4)或(c5)或(c6)：

(c1)结合细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白；

(c2)制备用于结合细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白的产品；

(c3)富集细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白；

(c4)制备用于富集细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白的产品；

(c5)检测细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白；

(c6)制备用于检测细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白的产品。

本发明还保护所述多肽的应用，为如下(d1)或(d2)：

(d1)与细菌Ⅵ型分泌系统中的毒素蛋白竞争性结合免疫蛋白；

(d2)制备用于与细菌Ⅵ型分泌系统中的毒素蛋白竞争性结合免疫蛋白的产品。

本发明还保护所述多肽的应用，为如下(f1)或(f2)：

(f1)解除细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白对毒素蛋白诱发的细菌死亡的抑制作用；

(f1)制备用于解除细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白对毒素蛋白诱发的细菌死亡的抑制作用的产品。

本发明还保护所述多肽的应用，为如下(g1)或(g2)：

(g1)促进具有细菌Ⅵ型分泌系统的细菌的死亡；

(g1)制备用于促进具有细菌Ⅵ型分泌系统的细菌的死亡的产品。

所述具有细菌Ⅵ型分泌系统的细菌具体可为铜绿假单胞菌。

以上任一所述毒素蛋白为TplE蛋白，具体为如下(h1)、(h2)、(h3)、(h4)、(h5)或(h6)：

(h1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(h2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质；

(h3)来源于铜绿假单胞菌且与序列1所示蛋白质具有90％以上同一性的蛋白质；

(h4)在(h1)的N端或/和C端连接标签得到的多肽；

(h5)在(h1)的N端连接信号肽得到的多肽；

(h6)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

以上任一所述免疫蛋白为TplEi蛋白，具体为如下(j1)、(j2)、(j3)、(j4)、(j5)或(j6)：

(j1)由序列表中序列2第26-380位氨基酸残基组成的蛋白质；

(j2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(j3)将(j1)或(j2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质；

(j4)来源于铜绿假单胞菌且与(j1)或(j2)具有90％以上同一性的蛋白质；

(j5)在(j1)或(j2)的N端或/和C端连接标签得到的蛋白质；

(j6)在(j1)或(j2)的N端连接信号肽得到的蛋白质。

随着细菌耐药性的逐渐增强，发展新型抗感染药物迫在眉睫。六型分泌系统(T6SS)其通过分泌毒力蛋白参与了原核细胞和真核细胞的感染，在生态系统平衡和人类健康方面起着重要作用。铜绿假单胞菌Ⅵ型分泌系统的效应蛋白TplE通过靶向竞争者细菌细胞膜引发其死亡，而其自身通过表达抗毒蛋白TplEi中和TplE毒性从而阻止自杀行为。

本发明提供的功能短肽可以与效应蛋白(TplE蛋白)竞争性结合免疫蛋白(TplEi蛋白)，从而破坏TplE-TplEi互作，从而促使效应蛋白裂解细菌自身的的细胞膜引发细菌自我死亡，这将是一个最有力的以T6SS效应蛋白为靶点的新型抗菌策略，将为设计新型抗感染药物提供最为直接的药物筛选平台和后期药物应用开发提供强有力科技支撑，为临床耐药菌株的治疗提供新方向。

附图说明

图1为A肽与His₆-TplEi的亲和力检测结果。

图2为B肽与His₆-TplEi的亲和力检测结果。

图3为实施例3的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

TplE蛋白即效应蛋白，又称毒素蛋白。铜绿假单胞菌来源的TplE蛋白如序列表的序列1所示。TplEi蛋白即免疫蛋白，又称抗毒蛋白。铜绿假单胞菌来源的TplEi蛋白如序列表的序列2所示，其信号肽为第1至25位，成熟肽为第26至380位。

petDUET-1载体：Novagen公司。大肠杆菌Rosetta(DE3)：Novagen公司。pET-28a(+)载体：Novagen公司。pET-26b(+)载体：Novagen公司。大肠杆菌BL21：Novagen公司。

实施例1、功能短肽的发现

1、采用petDUET-1载体为出发质粒构建重组质粒。重组质粒中，第一个开放阅读框表达N端具有His₆标签的TplEi成熟肽，第二个开放阅读框表达TplE蛋白。

2、将步骤1构建的重组质粒导入大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到重组菌。

3、培养步骤2得到的重组菌，培养过程中进行IPTG诱导，然后依次进行如下步骤：菌体破碎取上清、镍柱纯化、离子交换层析、Superose 6分子筛层析，得到TplE-TplEi复合物。

4、取步骤3得到的TplE-TplEi复合物，加入枯草杆菌蛋白酶进行原位酶解消化结晶，然后获取晶体并进行结构解析。

5、根据结构解析的结果制备多肽并进行功能验证，最终发现了两个功能短肽，分别命名为A肽和B肽。

A肽的氨基酸序列(序列表的序列3)：DDLFASIGALWTWAWRGPKARQELLKAEQVEVDD。

B肽的氨基酸序列(序列表的序列4)：DDLFASIGALWTWAWRGPKARQELLKAEQ。

实施例2、功能短肽对TplEi蛋白的亲和力

功能短肽与TplEi蛋白进行体外结合实验，确定功能短肽的亲和力。功能短肽的高亲和力是用于开发新型抗感染药物的第一步。

一、制备功能短肽

人工合成A肽。

人工合成B肽。

二、制备TplEi蛋白

1、将序列表的序列5第64-1131位核苷酸所示的双链DNA分子插入pET-28a(+)载体的NdeI和XhoI酶切位点之间，得到重组质粒。经测序验证，重组质粒中具有序列表的序列5所示的开放阅读框，表达N端具有His₆标签的TplEi成熟肽。

2、将步骤1得到的重组质粒导入大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到重组菌。

3、将步骤2得到的重组菌接种至含50mg/L卡那霉素和50mg/L氯霉素的液体LB培养基，37℃、180rpm振荡培养至OD_600nm值约为1.2。

4、完成步骤3后，将整个培养体系冰浴放置半小时，然后加入IPTG并使其在体系中的浓度为0.5mmol/L，然后18℃、180rpm振荡培养18小时。

5、完成步骤4后，4000rpm离心15min，收集菌体，用裂解液悬浮后在冰上进行超声破碎(功率600W，每工作5s停5s，99次)，然后15000rpm离心30min，收集上清液，将上清液进行0.45微米滤膜过滤，收集滤液。

裂解液：含2M NaCl、12mM imidazole、0.1％β-巯基乙醇、1mM PMSF，余量为pH7.5、50mM的Tris-HCl缓冲液。

6、Ni柱纯化

3ml镍离子亲和层析柱：QIAGEN。

纯化过程：①用10倍柱体积的平衡液平衡柱子；②上样步骤5得到的滤液；③用10倍柱体积的洗涤液洗涤柱子，以去除杂蛋白；④用15ml洗脱液洗脱柱子，收集过柱后溶液。

平衡液：含2M NaCl、12mM imidazole，余量为pH7.5、50mM的Tris-HCl缓冲液。

洗涤液(pH7.5)：含150mMNaCl、50mM Tris、12mM咪唑，余量为水。

洗脱液(pH7.5)：含75mM NaCl、50mM Tris、250mM咪唑、0.1％β-巯基乙醇，余量为水。

将过柱后溶液进行0.45微米滤膜过滤，收集滤液。

7、阳离子交换层析纯化

AKTA explore系统。

5ml Hitrap SP HP层析柱：GE HEALTHCARE。

纯化过程：①用5个柱体积的buffer A平衡柱子；②上样步骤6得到的滤液；③用buffer A和buffer B进行线性梯度洗脱，实时监测280nm的紫外值，收集洗脱峰(整个洗脱过程，仅出现一个明显的洗脱峰)对应的过柱后溶液。

buffer A(pH7.5)：含50mM Tris、75mM NaCl、1mM DTT，余量为水。

buffer B(pH7.5)：含50mM Tris、1M NaCl、1mM DTT，余量为水。

将过柱后溶液采用截留分子量为10KD的超滤浓缩管进行超滤浓缩，得到蛋白浓缩液。

8、分子筛层析纯化

24ml Superose 6柱层析柱：GE HEALTHCARE。

纯化过程：①用1个柱体积的分子筛缓冲液平衡柱子；②上样步骤7得到蛋白浓缩液；③用分子筛缓冲液进行洗脱，实时监测280nm的紫外值，收集洗脱峰(整个洗脱过程，仅出现一个明显的洗脱峰)对应的过柱后溶液。

分子筛缓冲液(pH7.0)：含150mMNaCl、20mMTris，余量为水。

将过柱后溶液采用截留分子量为10KD的超滤浓缩管进行超滤浓缩，得到蛋白浓缩液，即为含有N端具有His₆标签的TplEi成熟肽的溶液，命名为His₆-TplEi溶液。N端具有His₆标签的TplEi成熟肽用His₆-TplEi表示。

His₆-TplEi溶液中，His₆-TplEi的浓度为10mg/ml(以总蛋白浓度计)。

三、亲和力检测

采用MicroCal iTC200微量热等温滴定量热仪进行体外ITC实验。制备A肽溶液，A肽浓度为1-2mM。制备B肽溶液，B肽浓度为1-2mM。制备His₆-TplEi溶液的稀释液，稀释液的蛋白浓度为0.03-0.04mM。制备各个溶液和稀释液采用的溶剂均为如下：含20mM>

A肽与His₆-TplEi的亲和力检测结果见图1。kd＝125nM。

B肽与His₆-TplEi的亲和力检测结果见图2。kd＝478nM。

实施例3、功能短肽通过激活TplE蛋白引发细菌的自我死亡

一、构建重组质粒

1、将序列表的序列6所示的双链DNA分子插入pET-26b(+)载体的NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，得到重组质粒pET26b-TplE。经测序验证，重组质粒pET26b-TplE中具有序列表的序列6所示的开放阅读框。序列表的序列6所示的DNA分子编码序列表的序列7所示的蛋白质。序列表的序列7中，第1-23位氨基酸残基组成信号肽(促使蛋白分泌到周质空间)，第24-592位氨基酸残基组成TplE蛋白。

2、将序列表的序列8所示的双链DNA分子插入pET-26b(+)载体的NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，得到重组质粒pET26b-TplE-TplEi。经测序验证，重组质粒pET26b-TplE-TplEi中具有序列表的序列8所示的开放阅读框。序列表的序列8所示的DNA分子编码序列表的序列9所示的蛋白质。序列表的序列9中，第1-23位氨基酸残基组成信号肽(促使蛋白分泌到周质空间)，第24-592位氨基酸残基组成TplE蛋白，第593-972位氨基酸残基组成TplEi蛋白。

3、将序列表的序列10第1-171位核苷酸所示的双链DNA分子插入pET-26b(+)载体的NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，得到重组质粒pET26b-A。经测序验证，重组质粒pET26b-A中具有序列表的序列10所示的开放阅读框。序列表的序列10所示的DNA分子编码序列表的序列11所示的蛋白质。序列表的序列11中，第1-23位氨基酸残基组成信号肽(促使蛋白分泌到周质空间)，第24-57位氨基酸残基组成A肽。

4、将序列表的序列12第1-171位核苷酸所示的双链DNA分子插入pET-26b(+)载体的NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，得到重组质粒pET26b-K100E。经测序验证，重组质粒pET26b-K100E中具有序列表的序列12所示的开放阅读框。

5、将序列表的序列13第1-171位核苷酸所示的DNA分子插入pET-26b(+)载体的NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，得到重组质粒pET26b-W92A。经测序验证，重组质粒pET26b-W92A中具有序列表的序列13所示的开放阅读框。

二、细菌培养试验

第一组：将pET-26b(+)载体导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。

第二组：将重组质粒pET26b-TplE导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。

第三组：将重组质粒pET26b-TplE-TplEi导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。

第四组：将重组质粒pET26b-TplE-TplEi和pET-26b(+)载体共导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。

第五组：将重组质粒pET26b-TplE-TplEi和重组质粒pET26b-A共导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。

第六组：将重组质粒pET26b-TplE-TplEi和重组质粒pET26b-W92A共导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。

第七组：将重组质粒pET26b-TplE-TplEi和重组质粒pET26b-K100E共导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。

第八组：将pET-26b(+)载体和重组质粒pET26b-A共导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。

结果见图3。图3中，每一组自左至右，依次为菌液、菌液的10倍稀释液、菌液的100倍稀释液、菌液的10³倍稀释液、菌液的10⁴倍稀释液和菌液的10⁵倍稀释液。与第一组相比，第二组的重组菌存活数量显著降低，即TplE蛋白诱导细菌发生了死亡。与第二组相比，第三组的重组菌存活数量显著增加，即TplEi蛋白对TplE蛋白诱导细菌死亡具有抑制作用。与第四组相比，第五组重组菌存活数量显著降低，即A肽通过与TplE蛋白竞争性结合TplEi蛋白，解除了TplEi蛋白对TplE蛋白诱导细菌死亡的抑制作用，TplE蛋白得以释放发挥毒性作用，细菌死亡。与第五组相比，第六组以及第七组的重组菌存活数量显著增加，即将A肽进行点突变后，其相应的作用效果显著降低。第八组的结果表明，A肽本身对细菌基本不存在致死作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院病原生物学研究所

<120> 特异性结合铜绿假单胞菌六型分泌系统免疫蛋白的多肽的设计及其抗菌活性的验证

<130> GNCYX171704

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 569

<212> PRT

<213> P.Aeruginosa

<400> 1

Met Ser Ser Glu Pro Leu Glu Pro Asn Gln Asp Val Ile Ile Pro Arg

1 5 1015

Ser Arg Asp Ser Leu Gly Arg Pro Val Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg

202530

Thr Asp Asn Gln Ser Glu Lys Val Ala Leu Ile Arg Gln Thr Ala Pro

354045

Leu Pro Val Ile Phe Ile Pro Gly Ile Met Gly Thr Asn Leu Arg Asn

505560

Lys Ala Asp Lys Ser Glu Val Trp Arg Pro Pro Asn Gly Leu Trp Pro

65707580

Met Asp Asp Leu Phe Ala Ser Ile Gly Ala Leu Trp Thr Trp Ala Trp

859095

Arg Gly Pro Lys Ala Arg Gln Glu Leu Leu Lys Ala Glu Gln Val Glu

100 105 110

Val Asp Asp Gln Gly Thr Ile Asp Val Gly Gln Ser Gly Leu Ser Glu

115 120 125

Glu Ala Ala Arg Leu Arg Gly Trp Gly Lys Val Met Arg Ser Ala Tyr

130 135 140

Asn Pro Val Met Gly Leu Met Glu Arg Arg Leu Asp Asn Ile Val Ser

145 150 155 160

Arg Arg Glu Leu Gln Ala Trp Trp Asn Asp Glu Ala Leu Ser Pro Pro

165 170 175

Gly Asp Gln Gly Glu Glu Gln Gly Lys Val Gly Pro Ile Asp Glu Glu

180 185 190

Glu Leu Leu Arg Ala Ser Arg Tyr Gln Phe Asp Val Trp Cys Ala Gly

195 200 205

Tyr Asn Trp Leu Gln Ser Asn Arg Gln Ser Ala Leu Asp Val Arg Asp

210 215 220

Tyr Ile Glu Asn Thr Val Leu Pro Phe Tyr Gln Lys Glu Cys Gly Leu

225 230 235 240

Asp Pro Glu Gln Met Arg Arg Met Lys Val Ile Leu Val Thr His Ser

245 250 255

Met Gly Gly Leu Val Ala Arg Ala Leu Thr Gln Leu His Gly Tyr Glu

260 265 270

Arg Val Leu Gly Val Val His Gly Val Gln Pro Ala Thr Gly Ser Ser

275 280 285

Thr Ile Tyr His His Met Arg Cys Gly Tyr Glu Gly Ile Ala Gln Val

290 295 300

Val Leu Gly Arg Asn Ala Gly Glu Val Thr Ala Ile Val Ala Asn Ser

305 310 315 320

Ala Gly Ala Leu Glu Leu Ala Pro Ser Ala Glu Tyr Arg Glu Gly Arg

325 330 335

Pro Trp Leu Phe Leu Cys Asp Ala Gln Gly Gln Val Leu Lys Asp Ile

340 345 350

Asp Gly Lys Pro Arg Ala Tyr Pro Gln Asn Gln Asp Pro Tyr Glu Glu

355 360 365

Ile Tyr Lys Asn Thr Thr Trp Tyr Gly Leu Val Pro Glu Gln Asn Ser

370 375 380

Gln Tyr Leu Asp Met Ser Asp Lys Lys Glu Gly Leu Arg Val Gly Pro

385 390 395 400

Arg Asp Asn Phe Glu Asp Leu Ile Asp Ser Ile Ala Asn Phe His Gly

405 410 415

Glu Leu Ser Ala Ala Gly Tyr His Ser Glu Thr Tyr Ala His Tyr Gly

420 425 430

Ala Asp Asp Ser Arg His Ser Trp Arg Asp Leu Ile Trp Lys Gly Asp

435 440 445

Pro Thr Pro Leu Glu Thr Pro Gly Ala Thr Leu Asn Asp Asp Glu Asn

450 455 460

Gly Thr Tyr Asn Ser Trp Phe Arg Arg Gly Leu Pro Thr Ile Val Gln

465 470 475 480

Gly Pro Leu Glu Thr Gly Asn Pro Leu Asp Ala Ser Gly Ser Gly Gly

485 490 495

Asp Glu Thr Val Pro Thr Asp Ser Gly Gln Ala Pro Ala Leu Ala Gly

500 505 510

Val Lys Ala Ser Phe Arg His Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gln Ala Asn

515 520 525

Thr Lys Arg Gly Tyr Glu His Gln Glu Ser Tyr Asn Asp Ala Arg Ala

530 535 540

Gln Trp Ala Ala Leu Tyr Gly Val Ile Lys Ile Thr Gln Leu Ala Asp

545 550 555 560

Trp His Pro Asn Asp Lys Gly Gly Thr

565

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<212> PRT

<213> P.Aeruginosa

<400> 2

Met Met His Pro Arg Arg Leu Leu Ala Val Leu Gly Val Val Val Leu

1 5 1015

Thr Ser Met Thr Ser Cys Thr Ser Phe Ser Ser Ser Arg Ser Ser Ser

202530

Met Asp Lys Thr Gly Trp Ile Thr His Cys Phe Gly Arg Phe Leu Ile

354045

Asp Leu Pro Pro Asp Ala Val Ile Asn Ala Gly Tyr Tyr Leu Trp Gly

505560

Asp Arg Ile Glu Tyr Leu Asp Asp Lys Pro Thr Glu Leu Ala Ala Arg

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Val Asp Arg Leu Glu Gln Glu Trp Arg Thr Gln Arg His Lys Ser Lys

859095

Gly Asn Met Phe Leu Arg Lys Ile Asp Phe Gly Asn Glu Ser Val Gly

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Leu Leu Ser Trp Ser Ser Glu Val Ala Ser Lys Thr Tyr Leu Leu Asp

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Thr Tyr Val Thr Ser Lys Pro Thr Trp His Val Tyr Arg Trp Lys Gly

130 135 140

Lys Val Ser Val Asp Arg Glu Gln His Ala Val Glu Ile Ser Arg Ala

145 150 155 160

Leu Ala Arg Asn Leu Arg Ser Arg Ala Pro Lys Glu Ile Pro Ser Glu

165 170 175

Pro Gly Phe Cys Ile Asp His Ala Tyr Ile Ala Gly Asp Ser Phe Gln

180 185 190

Val Glu Arg Phe Gly Val Gly Val Thr Phe Pro Glu His Pro Gly Ala

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Arg Phe Glu Phe Arg Ser Ser Thr Gly Ala Glu Leu Asn Ser Leu Leu

210 215 220

Glu Arg Val Asp Gly Phe Val Gln Asn Met Leu Ser Thr Phe Ala Gly

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Met Glu Thr Leu Arg Lys Gly Lys His Pro Val Gly Ser Leu Pro Gly

245 250 255

Glu Glu Tyr Leu Val Ala Gly Ser Asp Lys Gly Gln Arg Gly Tyr Thr

260 265 270

Phe Met Trp Glu Val Gln Gly Lys Glu Glu Ser Leu Thr Glu Pro Asn

275 280 285

Leu Thr Ala Gly Leu Ala Val Leu Glu Arg Ser Asn Glu Asn Gly Lys

290 295 300

Pro Pro Pro Pro Ala Phe Lys Ser Asp Lys Glu Ala Leu Glu Leu Trp

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Asp Thr Ile Val Asp Ser Ile Arg Val Arg Pro Thr Ser Ser Ser Pro

325 330 335

Arg Gly Gly Asn Ala Gly Pro Ser Pro Ala Pro Lys Pro Ala Thr Pro

340 345 350

Gly Gly Gln Thr Leu Gly Asp His Tyr Val Tyr Glu Glu Phe Leu Ser

355 360 365

Ser Leu Lys Pro Lys Asp Ser Trp Leu Asp Asp Leu

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<212> PRT

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Asp Asp Leu Phe Ala Ser Ile Gly Ala Leu Trp Thr Trp Ala Trp Arg

1 5 1015

Gly Pro Lys Ala Arg Gln Glu Leu Leu Lys Ala Glu Gln Val Glu Val

202530

Asp Asp

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<212> PRT

<213> Artificial sequence

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Asp Asp Leu Phe Ala Ser Ile Gly Ala Leu Trp Thr Trp Ala Trp Arg

1 5 1015

Gly Pro Lys Ala Arg Gln Glu Leu Leu Lys Ala Glu Gln

2025

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atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

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gacagaattg agtacttaga tgataaacct accgaactgg cagccagggt tgatcgtctt 240

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gactttggca atgaatcagt aggtttattg tcttggtctt cagaggttgc ctctaaaacc 360

tatttattgg atacctatgt tacatctaag cctacgtggc atgtctatcg ttggaaaggg 420

aaagtttcgg tagacagaga gcaacatgct gtggagatat ctagggcttt agctcgaaat 480

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tatattgcag gggatagttt tcaagtggag aggtttggag tgggagtcac tttccctgag 600

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<212> DNA

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atgggaacca acctgcgcaa caaggcagat aaaagcgagg tctggaggcc gccgaatggt 300

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acgatcgatg tcggtcaatc tggtttgtcc gaagaagctg cccgcctgcg cggctggggc 480

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atcgtcagcc ggcgggaact ccaggcatgg tggaatgacg aagccctctc tcctcctgga 600

gatcagggtg aggagcaggg aaaggttggg ccgatcgatg aagaggaatt gctcagggcc 660

agccgatacc agttcgatgt ctggtgcgcc ggctataact ggctacagtc caaccggcag 720

tcggcgctgg atgtacgcga ctatatcgag aataccgtgt tgcctttcta ccaaaaggag 780

tgcggtctcg atcccgagca gatgagacgt atgaaggtca ttctggtcac ccattcgatg 840

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485 490 495

Gly Leu Pro Thr Ile Val Gln Gly Pro Leu Glu Thr Gly Asn Pro Leu

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515 520 525

Gln Ala Pro Ala Leu Ala Gly Val Lys Ala Ser Phe Arg His Gly Ser

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