脊髓NF-κB/p65介导的神经免疫调节在大鼠佐剂性关节炎发病中的作用及机制研究

摘要

研究背景:
　　类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)，是一种由自身免疫障碍引致免疫系统攻击关节的长期慢性炎症。这种炎症会造成关节变形直至残废，并会因关节疼痛及磨损而失去部分的活动能力，会极大影响患者的生活质量。尽管目前存在很多抗风湿类药物，如非甾类抗炎药（Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs，NSAIDs）、慢作用抗风湿药、肾上腺糖皮质激素等，其中新近开发研究的也为数不少，包括肿瘤坏死因子-a(Tumor necrosis factor,TNF-a)阻断剂、抗CD20单抗、炎性因子的中和抗体[白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白介素-1(interleukin-1，IL-1)]。但是探索类风湿致病机理，并且依此研发相关新药仍是医学界的热点。
　　众所周知，外周组织损伤或炎症会引起脊髓一系列的变化，在关节炎的发生发展过程中，受损的关节组织以及滑膜炎可激活外周伤害性感受器，导致连续和强烈的伤害性信号向上传入脊髓进行调制、整合，这样可能会诱发脊髓的神经免疫反应，从而引起细胞因子、兴奋性氨基酸、环氧化酶-2(cyclooxygenase，COX-2)和前列腺素的产生和分泌，进而导致脊髓伤害性神经元的持续兴奋性增强（即中枢敏化）。有意思的是，脊髓也可以通过信号传递调节外周炎症。有确切证据表明，鞘内给予的相关的一些化合物可减轻外周炎症，这些化合物包括腺苷、色胺、氯胺酮和吗啡、沙利度胺、星形胶质细胞和小胶质细胞抑制剂、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)p38拮抗剂等。而这些化合物具有一个共同的效应:减少脊髓神经元的兴奋性。另外，一些涉及调节外周炎症的通路已经被阐明，其中包括由交感神经和副交感神经分支组成的自主系统，其支配免疫器官，并可以影响外周的免疫反应。另一种机制即背根反射(dorsal root reflexes，DRR)，可沿躯体传入神经纤维逆向传递信号，促使感觉神经末梢释放神经肽，如血管活性肠肽、P物质和降钙素基因相关肽，从而影响周围炎症。此外，下丘脑-垂体-肾上腺(Hypothalamic-Pituitary-Adrenal，HPA)轴也可以对炎症形成反馈机制，其往往涉及自身免疫和炎性相关疾病，如类风湿性关节炎。
　　核因子-κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)是一种关键性的转录因子，参与了中枢神经系统（central nervous system，CNS）许多生理活动或病理过程，如炎症、神经元可塑性、突触传递、学习、记忆和疼痛。NF-κB通过调控众多基因来实现这些过程，其中包括细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α），促炎症酶COX-2和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），趋化因子和粘附因子。NF-κB的5个亚基已经确定，包括gp105/p50（NF-κB1）、p100/p52(NF-κB2)、p65（RelA）、RelB和c-REL，NF-κB的活性形式是这些亚基组成的二聚体。NF-κB最常见和最具特点的二聚体是p50/p65，其广泛表达于中枢神经系统，在基因表达的调节中起着重要的作用。先前的研究表明，外围组织损伤或炎症可活化脊髓NF-κB/p65，我们的早期工作也发现NF-κB/p65与TNF-α共表达于慢性压迫性损伤模型大鼠的脊髓背角，下调脊髓NF-κB/p65的表达可显著降低坐骨神经结扎引起的机械痛觉过敏和热痛觉过敏。这些研究结果表明NF-κB/p65参与了中枢敏化。然而，尚不确定脊髓NF-κB/p65是否也参与了外周炎症的发生发展。
　　本研究首先构建NF-κB/p65基因RNA干扰（RNA interference，RNAi）慢病毒载体并转染体外培养的大鼠脊髓神经元和星形胶质细胞，观察其沉默效应以及对IL-1β、TNF-α和COX-2表达的影响。在体建立大鼠佐剂性关节炎（adjuvant-induced arthritis，AIA）模型，鞘内注射慢病毒重组体，探讨脊髓NF-κB/p65在AIA大鼠外周炎症和痛觉过敏中作用。另外，我们还评估了NF-κB/p65对脊髓IL-1β、TNF-α和COX-2表达的调控作用，以阐明脊髓NF-κB/p65参与外周炎症和痛觉过敏的相关机制。
　　第一部分:慢病毒介导RNA干扰对体外培养大鼠脊髓神经元和星形胶质细胞NF-κB/p65基因的沉默效应
　　目的:
　　构建NF-κB/p65基因RNA干扰慢病毒载体并转染体外培养的大鼠脊髓神经元和星形胶质细胞，观察其沉默效应以及对IL-1β、TNF-α和COX-2表达的影响
　　方法:
　　1.针对大鼠NF-κB/p65基因特异性序列，设计3条NF-κB/p65-siRNA序列及1条阴性对照序列，合成包含各正反义靶序列的互补DNA链，退火形成双链DNA，插入到经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后的pFU-GW慢病毒载体中，PCR筛选阳性克隆，DNA测序鉴定。与慢病毒包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0通过lipofectamine 2000共转染至包装细胞293T，滴度测定后-80°冰箱保存备用。
　　2.体外培养神经元和星形胶质细胞，用免疫荧光技术进行细胞纯度鉴定。
　　3.慢病毒重组体转染体外培养的大鼠脊髓神经元和星形胶质细胞，观察转染效率。然后用含1μg/ml脂多糖(Lipopolyssacride，LPS)的培养液刺激细胞24h。根据干预条件不同，实验分为6组:阴性对照组、LPS组、LPS+LV-NC组、LPS+LV-shNF-κB/p65-1组、LPS+LV-shNF-κB/p65-2组和LPS+LV-shNF-κB/p65-3组。
　　4.倒置显微镜下观察神经元和星形胶质细胞的形态改变，Real-Time PCR和Western blotting技术分别检测慢病毒重组体对神经元和星形胶质细胞NF-κB/p65mRNA和蛋白的干扰效率，ELISA法检测培养基中星形胶质细胞分泌的炎性因子(IL-1β、TNF-α)的变化，Western blot技术检测神经元和星形胶质细胞COX-2的表达情况。
　　结果:
　　1.测序结果证实合成的寡核苷酸链插入正确，重组载体构建成功，测定慢病毒滴度为108～9TU/mL。
　　2.培养神经元7d后使用神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）特异性抗体对其进行纯度鉴定，结果显示85％以上为神经元。培养星形胶质细胞12d后进行传代，传代2次后使用神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)特异性抗体对其进行纯度鉴定，结果显示达90％以上为星形胶质细胞。
　　3.慢病毒重组体能成功转染大鼠脊髓神经元和星形胶质细胞，神经元转染效率大于90％，与LV-NC组比较，LPS+LV-shNF-κB/p65-1组和LPS+LV-shNF-κB/p65-2组NF-κB/p65mRNA和蛋白的表达都明显下调，mRNA水平干扰效率达95％(P＜0.01)，蛋白水平干扰效率达85％以上(P＜0.01)，而LPS+LV-shNF-κB/p65-3组无明显下调(P＞0.05)。相比阴性对照组，神经元的LPS组COX-2表达无明显变化，LV-shNF-κB/p65-1和LV-shNF-κB/p65-2能下调COX-2的表达，而LV-shNF-κB/p65-3则无明显作用。另外，星形胶质细胞转染效率大于85％，与LV-NC组比较，LPS+LV-shNF-κB/p65-1组和LPS+LV-shNF-κB/p65-2组NF-κB/p65mRNA和蛋白的表达明显下调，mRNA水平干扰效率达92％(P＜0.01)，蛋白水平干扰效率达83％以上(P＜0.01)，而LPS+LV-shNF-κB/p65-3组无明显变化(P＞0.05)。相比阴性对照组，星形胶质细胞LPS组的TNF-α、IL-1β和COX-2蛋白表达明显上调(TNF-α，P＜0.01;IL-1β，P＜0.01;COX-2，P＜0.05)，LV-shNF-κB/p65-1和LV-shNF-κB/p65-2能抑制这种上调效应(P＜0.01)，而LV-shNF-κB/p65-3组无这种作用。
　　结论:
　　成功构建了大鼠NF-κB/p65基因的RNA干扰慢病毒载体，其可使大鼠脊髓神经元和星形胶质细胞的NF-κB/p65基因表达下调，并能抑制LPS导致的TNF-α、IL-1β和COX-2的上调效应。这样为我们下一步动物体内实验奠定了坚实的基础，也为神经系统NF-κB/p65基因功能研究提供一种有效的工具。
　　第二部分:脊髓NF-κB/p65对大鼠佐剂性关节炎外周炎症以及痛觉过敏的调控作用
　　目的:
　　炎症组织的伤害性刺激可能增加脊髓背角神经元的兴奋性（即中枢敏化），兴奋的神经元可返回信号并调控外周炎症，但是其中的机制尚不明确。最近的一些研究表明，脊髓NF-κB/p65参与了中枢敏化以及相关疼痛。我们的目的是研究脊髓NF-κB/p65是否也参与了大鼠佐剂性关节炎的外周炎症反应及相关痛觉过敏。
　　方法:
　　1.构建大鼠佐剂性关节炎模型，在完全性弗氏佐剂(completeFreund'sadjuvant，CFA)注射后第3d或10d，鞘内给予10ul慢病毒重组体(LV-NF-κB/p65或LV-NC)。根据干预条件不同，实验分为8组:对照组、CFA组、CFA+LV-NC(3d)组、CFA+LV-shNF-κB/p65-1(3d)组、CFA+LV-shNF-κB/p65-2(3d)组、CFA+LV-NC(10d)组、CFA+LV-shNF-κB/p65-1(10d)组、CFA+LV-shNF-κB/p65-2(10d)组。
　　2.CFA注射后第14d，使用Westernblot技术、免疫荧光技术以及EMSA技术评估脊髓NF-κB/p65蛋白的表达和转录活性。在CFA注射前1d和注射后第6d、第8d、第10d、第12d、第14d、第16d、第18d以及第20d，对大鼠的疼痛相关行为、足跖肿胀程度进行了评估，在第20d，观察评估大鼠的关节组织病理学改变。此外，在CFA注射后第14d，检测脊髓炎性介质TNF-α，IL-1β和COX-2的表达。
　　结果:
　　1.外周炎症上调了脊髓NF-κB/p65蛋白的表达，其主要分布于脊髓背角的神经元和星形胶质细胞，CFA注射后第3d或10d，鞘内注射LV-shNF-κB/p65-1和LV-shNF-κB/p65-2都能下调NF-κB/p65蛋白的表达和转录活性。
　　2.相比阴性对照组，CFA组大鼠的机械痛阈、热痛阈明显下降(P＜0.01)，而足跖肿胀明显增加(P＜0.01)，CFA注射后第3d或10d，鞘内给予LV-shNF-κB/p65-1和LV-shNF-κB/p65-2都能显著抑制这些效应(P＜0.01)。另外，相比CFA+LV-NC(3d)组，大鼠关节炎症和组织破坏程度在CFA+LV-shNF-κB/p65-2(3d)组显著降低（P＜0.01），而LV-shNF-κB/p65-1(10d)组轻微降低，但未达统计学意义(P＞0.05);此外，相比CFA+LV-NC(10d)组，CFA+LV-shNF-κB/p65-1(10d)组和LV-shNF-κB/p65-2(10d)组的关节炎症和组织破坏程度无明显变化(P＞0.05)。CFA注射后第3d，鞘内给予LV-shNF-κB/p65-1能下调脊髓TNF-α和IL-1β的表达（P＜0.01），但对COX-2的表达无明显作用(P＞0.05)，而LV-shNF-κB/p65-2能抑制脊髓TNF-α，IL-1β和COX-2表达(TNF-α，P＜0.01;IL-1β，P＜0.01;COX-2，P＜0.05)。CFA注射后第10d，鞘内注射LV-shNF-κB/p65-1能下调脊髓TNF-α的表达（P＜0.05），对IL-1β无显著作用(P＞0.05)，而LV-shNF-κB/p65-2能同时抑制TNF-α和IL-1β的表达(P＜0.05)，但两者都对COX-2无明显作用(P＞0.05)。
　　结论:
　　外周炎症上调了脊髓NF-κB/p65蛋白的表达，其主要分布于脊髓背角的神经元和星形胶质细胞。鞘内注射LV-shNF-κB/p65能下调NF-κB/p65蛋白的表达，并且能降低大鼠的痛觉过敏、足跖肿胀以及关节破坏。此外，其也能减少脊髓TNF-α，IL-1β和COX-2的过表达。这些表明脊髓NF-κB/p65在AIA大鼠外围炎症和痛觉过敏的发生发展过程中起着重要作用。因此，抑制脊髓NF-κB/p65的表达对外周炎症性疾病可能是一种潜在的治疗方法。