硫酸化可德兰多糖的制备、体外免疫调节、抗乙肝病毒感染活性及体内用作乙肝疫苗佐剂研究

摘要

研究目的：
　　乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染可以造成急慢性肝脏疾病，如病毒性肝炎、肝硬化及肝癌等，是危害人类健康的主要病因。我国HBV携带者约占全国总人口的10％，是乙型肝炎的高发区。目前临床使用抗HBV感染的典型药物有拉米夫定和α-干扰素，但是存在容易诱发病毒耐药突变以及副作用较多的问题，限制了疗效的发挥。HBV感染能够破坏机体免疫平衡，导致机体抗病毒免疫功能低下或紊乱，因此，抑制HBV感染需要激活机体抗病毒免疫应答。给易感人群接种乙肝疫苗是预防HBV感染的有效手段，但是仍有5％-10％的人接种后抗体水平很低或者无应答。铝佐剂是目前唯一可以用于乙肝疫苗的佐剂，虽然较安全，但是因其不能引起机体细胞免疫应答，使疫苗在预防和治疗HBV感染方面存在一定的不足，因而研制新型乙肝疫苗佐剂尤为重要。
　　可德兰多糖（curdlan）是由产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）发酵产生的一种胞外多糖，具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗凝血等活性，因其安全无毒且加热可成凝胶，被FDA批准用于食品工业。研究发现，curdlan硫酸化产物—硫酸化可德兰(curdlan sulfate)具有良好的抗HIV活性，并已对其开展Ⅱ期临床试验。鉴于curdlan和curdlan sulfate二者良好的免疫调节及抗病毒活性，我们期望通过本课题研究能够得到一种具有抗病毒感染作用的免疫调节剂，能够在免疫治疗方面发挥抗HBV感染的作用，同时还能增强重组乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)的免疫原性，改善疫苗在预防和治疗HBV感染方面的应用。
　　通过研究curdlan sulfate对小鼠免疫相关细胞的影响，考察其体外免疫调节活性，采用表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)技术研究其结合的受体;利用HepG2.2.15细胞上清液浓缩得到的HBV感染HepG2及HepaRG细胞，研究curdlan sulfate是否可以干扰病毒感染细胞的过程，并用SPR技术研究多糖与重组HBsAg的结合情况;最后，将curdlan sulfate与重组HBsAg联合注射BALB/c小鼠，研究其能否增强疫苗的免疫原性，提高产生的抗体水平。本课题研究将为curdlan sulfate开发成为一种新型抗HBV的免疫预防及治疗剂提供重要的依据和基础。
　　研究方法：
　　1、Curdlan sulfate的制备及结构表征
　　首先我们采用DMSO为溶剂、SO3-吡啶为硫酸化试剂，对curdlan进行修饰。通过控制反应温度，制备出四种curdlan sulfates。采用红外光谱分析技术鉴定所制备样品结构，凝胶渗透色谱-多角度激光散射(GPC-MALLS)联用技术测定重均分子量((M)w)，元素分析仪测定硫(S)含量。
　　2、Curdlan sulfate体外免疫调节活性及机制的研究
　　分离小鼠脾淋巴细胞，采用MTT法测定curdlan sulfate对其增殖的影响。采用小鼠RAW264.7细胞系，研究curdlan sulfate对巨噬细胞活化的作用，包括:用细胞吞噬中性红和FITC-dextran实验来分析其对巨噬细胞吞噬功能的影响;Griess试剂法测定RAW264.7细胞经curdlan sulfate作用后产生NO的水平;ELISA试剂盒测定curdlan sulfate对RAW264.7分泌IL-6、IL-1β及TNF-α细胞因子的影响;iNOS、IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平采用荧光定量PCR(FQ-PCR)进行分析。分离并培养小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)，采用流式细胞术检测curdlan sulfate对BMDCs表面成熟标志分子表达的影响。机制研究采用Western blot实验检测RAW264.7细胞中丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)途径相关蛋白的表达以及NF-κB的活化情况，并运用SPR技术分析curdlan sulfates与小鼠重组dectin-1的结合情况。
　　3、Curdlan sulfate体外抗HBV感染活性及机制的研究
　　采用PEG8000对HepG2.2.15细胞上清液进行浓缩得到HBV，用其感染HepG2及HepaRG细胞。采用FQ-PCR测定受感染细胞中HBVDNA的含量来考察curdlan sulfate对HBV黏附及入胞过程的影响;用HBsAg及HBeAg ELISA试剂盒检测受感染细胞培养第7d的细胞上清中HBsAg及HBeAg的含量，来考察curdlan sulfate对HBV感染细胞的影响;采用氯酸钠及硫酸乙酰肝素酶（HPA）处理HepG2及HepaRG细胞，用FQ-PCR检测HBV感染细胞的情况，并进一步用SPR技术分析curdlan sulfates与重组HBsAg的结合情况，探讨硫酸根在curdlan sulfate与HBsAg结合中的作用，并进一步分析其作用机制。
　　4、Curdlan sulfate体内用作乙肝疫苗佐剂的研究
　　Curdlan sulfate与重组HBsAg联合免疫BALB/c小鼠，于第0、14、28d共接种3次，第35d取小鼠脾淋巴细胞，采用流式细胞仪检测脾淋巴细胞巨噬细胞募集和树突状细胞成熟、CD4+、CD8+分群以及CD4活化情况;取小鼠脾淋巴细胞进行体外培养并用HBsAg再刺激，测定其增殖能力以及分泌IFN-γIL-17A、IL-4、IL-10的水平;流式细胞术胞内染色法分析小鼠脾淋巴细胞中Th1、Th2及Th17类细胞因子的胞内表达情况。另外，在每次免疫后7d收集小鼠血清，用anti-HBs ELISA试剂盒测定血清中抗体的含量，并用间接ELISA方法测定anti-HBs免疫球蛋白亚型IgG1、IgG2a的含量，分析小鼠产生的免疫应答类型。
　　研究结果：
　　1、Curdlan sulfate的制备及结构表征
　　通过控制反应条件，共制备了四种不同分子量及S含量的curdlan sulfates，分别命名为CS1、CS2、CS3及CSⅢ。红外光谱检测结果显示，curdlan sulfates在curdlan原有特征吸收峰基础上，在1258cm-1及816cm-1附近处出现了不对称S=O的伸缩振动峰及对称C-O-S的伸缩振动峰，说明curdlan已被成功硫酸化修饰。CS1、CS2、CS3和CSⅢ的(M)w经GPC-MALLS测定为25.87kDa、87.03kDa、171.9kDa和62.54kDa，S含量分别为（4.806±0.30）％、（6.288±0.03）％、（9.340±0.16）％和(7.312±0.11)％。由于CS3含有最高的S含量，下面的活性检测均采用CS3样品进行实验。
　　2、CS3体外免疫调节活性与MAPKs途径有关
　　CS3促进小鼠细胞脾淋巴细胞增殖效果显著，在400μg/mL时增殖率达到85.87％，但对RAW264.7细胞的增殖没有明显作用。CS3能增强RAW264.7吞噬中性红及FITC-dextran的能力，显著提高细胞产生NO、IL-6、IL-1±及TNF-α的水平，而且对细胞中iNOS、IL-6、IL-1±和TNF-αmRNA的水平也有一定的提高，并呈剂量依赖性。另外，CS3可促进BMDCs上调表达MHCII、CD11c、CD40、CD80、CD86分子，产生IL-12和IL-6，刺激细胞成熟。
　　Western blot结果显示CS3可以通过促进MAPKs途径中Erk1/2和SAPK/JNK的磷酸化来传递信号，活化NF-κB，提高iNOS的表达。SPR技术表明curdlan sulfates可以与curdlan已知受体dectin-1结合，说明curdlan经硫酸化修饰后主要受体并未改变。
　　3、CS3可以抑制HBV感染的黏附过程
　　FQ-PCR结果显示，CS3可以抑制HBV与HepG2及HepaRG细胞的黏附，500μg/mL时的抑制率为分别52.06％、50.43％;HBV感染细胞后上清中HBsAg及HBeAg的测定结果表明，CS3可以抑制HBV对细胞的感染。CS3对黏附过程的抑制率远高于其对HBV感染细胞的抑制率，说明CS3抗HBV感染的作用阶段主要是干扰病毒黏附入胞过程，而不是干扰病毒DNA复制等过程。
　　氯酸钠和HPA作用的细胞不表达或低表达硫酸乙酰肝素(HS)，用HBV感染分别经氯酸钠和HPA处理后的HepG2细胞，发现病毒感染水平分别降低为阴性对照的（11.44±2.30）％和（57.17±0.79）％;感染经二者处理后的HepaRG细胞，感染率分别降低为阴性对照的（9.86±2.29）％和（49.70±16.07）％。SPR技术分析发现curdlan sulfates可以与重组HBsAg结合，并且硫酸根含量越高，亲和力越强，提示CS3可能与HBV包膜蛋白结合，干扰HBV入胞。
　　4、CS3可以增强重组HBsAg免疫原性
　　流式细胞术检测经3次免疫接种后的小鼠脾淋巴细胞结果表明，CS3联合重组HBsAg免疫小鼠，可以促进巨噬细胞在脾脏中的募集，F4/80阳性细胞数增加，占脾淋巴细胞总数的（34.27±3.47）％，明显高于商品HB疫苗(HBvaccine)组（**p＜0.01）;同时可以刺激树突状细胞的成熟，使细胞高表达MHCII、CD11c、CD40和CD86分子;CD4+及CD8+T细胞亚群在脾淋巴细胞中的比例明显升高，与HB vaccine相比有显著性差异（*p＜0.05），且CD4+CD69+细胞数与单独注射HBsAg相比有显著性增加;分离小鼠脾淋巴细胞进行HBsAg体外再刺激，发现经CS3作用的小鼠脾细胞增殖能力增强，分泌Th1类型细胞因子IFN-γ的量明显高于HB vaccine组（**p＜0.01），CS3在高剂量时可以促进Th2类型细胞因子IL-4和IL-10的产生，但在低、中剂量时则作用不明显甚至有一定的抑制作用，而对Th17类细胞因子IL-17A则没有明显作用;采用流式细胞术分析胞内Th1及Th2类细胞因子蛋白的表达情况与细胞上清中测定结果一致。
　　小鼠血清中anti-HBs检测结果显示，CS3可以明显提高HBsAg产生的anti-HBs水平，高剂量组要明显优于HB vaccine组。Anti-HBs免疫球蛋白亚型IgG1的水平经CS3作用后下降，IgG2a的水平显著升高，且Ig2a/IgG1的值与HB vaccine组相比明显升高（*p＜0.05），说明CS3用作HBsAg佐剂可以使机体免疫类型向Th1方向发展。
　　创新性和结论：
　　(1)首次采用DMSO/SO3-吡啶反应体系，制备了不同(M)w和S含量的curdlan sulfates，此法安全方便，毒性较低，并且所得样品的(M)w和S含量随反应温度的升高而降低。
　　(2)首次研究了curdlan sulfate的体外免疫调节活性，样品CS3可以促进小鼠脾淋巴细胞增殖、RAW264.7细胞活化及BMDCs成熟。
　　(3)首次采用SPR技术研究了curdlan sulfate与curdlan已知受体dectin-1的结合情况，确定dectin-1是curdlan sulfate的主要受体，明确CS3发挥体外免疫调节活性的机制是通过与免疫细胞表面dectin-1受体结合，激活MAPKs信号通过中的Erk1/2和SAPK/JNK途径，导致NF-κB向核内移位，调节相关基因的转录。
　　(4)首次研究了curdlan sulfate体外抗HBV感染的活性，发现CS3可以抑制HBV感染HepG2和HepaRG细胞，并且主要是干扰HBV黏附细胞的过程。
　　(5)采用氯酸钠、HPA处理HepG2和HepaRG细胞发现HS在HBV感染细胞过程中发挥一定的作用，借助SPR技术研究curdlan sulfates与重组HBsAg的结合能力，提示CS3发挥体外抗HBV感染活性的机制可能是通过与HBV包膜蛋白结合，干扰HS-HBV的相互作用，影响HBV与靶细胞的黏附和融合。
　　(6)首次进行了curdlan sulfate用作乙肝疫苗佐剂的研究，CS3可以提高重组HBsAg的免疫原性，增强小鼠机体的免疫水平，提高血清中抗体滴度，并且主要诱导机体免疫应答向Th1型发展。

目录

声明

摘要

缩略语说明

第一章 前言

1 HBV感染

1．1 HBV

1．2 HBV生命周期

1．3 HBV入胞机制

1．4 HBV感染与机体免疫应答

2 Curdlan

2．1 Curdlan的结构与性质

2．2 Curdlan衍生物的制备方法及活性研究

3 硫酸化多糖抗病毒活性研究

4 多糖用作疫苗佐剂的研究

5 本课题设计思路及拟解决问题

第二章 硫酸化可德兰多糖及可德兰寡糖的制备及结构表征

1 实验材料

1．1 试剂与材料

1．2 实验设备

2 实验方法

2．1 硫酸化可德兰多糖(eurdlan sulfate)的制备

2．2 可德兰寡糖(CRDO)的制备

2．3 Curdlan sulfate及CRDO的结构分析

3 实验结果

3．1 Curdlan sulfates

3．2 CRDO

4 讨论

5 结论

第三章 Curdlan sulfate体外免疫调节活性及机制的研究

1 实验材料

1．1 试剂与材料

1．2 仪器设备

1．3 细胞株

1．4 实验动物

1．5 溶液配制

2 实验方法

2．1 CS3对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

2．2 CS3对小鼠RAW264．7细胞的影响

2．3 CS3对小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)成熟的影响

2．4 SPR技术分析不同curdlan sulfates与dectin-1的结合性质研究

3 实验结果

3．1 CS3对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

3．2 CS3对小鼠RAW264．7细胞活化的影响

3．3 CS3对小鼠BMDCs成熟的影响

3．4 Curdlau sulfates与dectin-1的结合性质研究

4 讨论

5 结论

第四章 Curdlan sulfate体外抗乙肝病毒感染活性及机制的研究

1 实验材料

1．1 试剂与材料

1．2 仪器设备

1．3 细胞株

1．4 溶液配制

2 实验方法

2．1 HBV浓缩液制备

2．2 HBV感染易感细胞

2．3 SPR分析硫酸化多糖与rHBsAg的结合性质研究

2．4 氯酸钠对HBV感染HepG2、HepaRG细胞的影响

2．5 HPA对HBV感染HepG2、HepaRG的影响

3 实验结果

3．1 CS3对HBV感染易感细胞的影响

3．2 硫酸化多糖与rHBsAg亲和力分析

3．3 氯酸钠对HBV感染HepG2、HepaRG细胞的影响

3．4 HPA对HBV感染HepG2、HepaRG细胞的影响

4 讨论

5 结论

第五章 Curdlan sulfate用于重组乙肝疫苗佐剂的研究

1 实验材料

1．1 试剂与材料

1．2 仪器设备

1．3 实验动物

1．4 溶液配制

2 实验方法

2．1 动物分组及免疫接种

2．2 小鼠脾淋巴细胞制备

2．3 流式细胞术分析小鼠脾淋巴细胞表面标志分子

2．4 小鼠脾淋巴细胞体外增殖实验

2．5 小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-17A、IL-4、IL-10细胞因子检测

2．6 细胞内染色法检测胞内细胞因子IFN-γ、IL-17A、IL-4

2．7 小鼠血清中anti-HBs抗体滴度测定以及HBsAg特异性IgG亚型含量测定

3 实验结果

3．1 CS3对免疫小鼠脾脏中巨噬细胞及树突状细胞募集和成熟的影响

3．2 CS3对小鼠脾脏中T淋巴细胞分群及活化的影响

3．3 CS3对小鼠脾淋巴细胞体外增殖能力的影响

3．4 CS3对小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-10及IL-17A细胞因子的影响

3．5 CS3对小鼠脾淋巴细胞胞内表达IFN-γ、IL-4及IL-17A蛋白的影响

3．6 CS3对小鼠外周血中淋巴细胞胞内表达IFN-γ及IL-17A蛋白的影响

3．7 CS3对免疫小鼠体内产生anti-HBs及HBsAg特异性免疫球蛋白亚型IgG1、IgG2a的影响

4 讨论

5 结论

总结与展望

1 全文总结

2 创新点

3 展望

参考文献

Article 1

Article 2

Article 3

致谢

博士期间发表的论文